2002 Fiscal Year Annual Research Report
有用な生物活性を有するC型レクチンドメイン含有蛋白質コード遺伝子の網羅的解析
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14580655
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| Research Institution | Meiji Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
阿刀田 英子 明治薬科大学, 薬学部, 助教授 (20221046)
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| Keywords | C型レクチン / ハブ / ゲノム / 抗凝固蛋白質 / 凝固IX因子 / X因子結合蛋白質 |
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| Research Abstract |
ヘビ毒に含まれる様々な生物活性を有する種々のC型レクチン様ドメイン含有蛋白質のゲノム構造を解析する試みの第一歩として、まずハブ・ゲノム中に存在する抗凝固蛋白質である血液凝固IX因子/X因子結合蛋白質(IX/X-bp)遺伝子の単離を試みた。
ハブ血液から細胞分画により白血球を分離し、定法に従ってゲノムDNAを抽出した得られたゲノムDNAを制限酵素Sau 3A1で部分切断し、アガロース電気泳動により断片の大きさを確認後、制限酵素Bam H1で切断したベクターLambda EMBL3にライゲーションした。これをパッケージングして、1.6x 10^5個の独立したクローンを含むハブ・ゲノムライブラリーを作製した。
ハブ毒腺cDNAライブラリーより単離したIX/X-bp A鎖cDNAを含むクローンを培養し、プラスミドを調製した。これから、インサートDNAを制限酵素Sal I及びNot Iによる消化により切り出しA鎖全長cDNAとし、これをDIGラベルすることにより、A鎖全長プローブを作製した。また、A鎖全長cDNAを制限酵素Bss HIIにより切断し、IX/X-bp A鎖のN末端側約1/3を含むA-5'cDNAとIX/X-bp A鎖のC末端側約2/3を含むA-3'cDNAを調製し、これらもDIGラベルした。
上記ハブ・ゲノムライブラリーについて、DIGラベルしたA鎖全長プローブ等を用いてスクリーニングした結果、IX/X-bp A鎖遺伝子を含むクローンを単離することができたので、現在その塩基配列を解析中である。
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