イノシトールリン酸化の細胞生物学における機能-5位のリン酸化

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14580690
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 柴崎 芳一 東京大学, 先端科学技術研究センター・科学技術振興特任教員(常勤形態)(特任教授) (80196419)
• Keywords: 小胞輸送 / アクチン / エンドサイトーシス / イノシトール / リン酸化酵素 / 細胞骨格

Research Abstract

(研究代表者の移籍に伴い研究設備、研究分担者に変更があるため、研究計画に変更がある。具体的には生細胞における分子イメージングを中心に解析した。)
(1)生細胞内メージングの検討
生細胞解析のため倒立顕微鏡にビデオカメラを設置し、どのフィルターが複数染色シグナルを重なり少なく検出できるかを検討し、系の最適化を行った。
(2)PIP5Kの小胞輸送への作用
PIP5K発現で細胞内小胞を基点としてアクチンの「尾」が観察された。アクチンにCFPを、PIP5KにYFPをそれぞれ結合させ、細胞に導入して、生細胞ビデオ観察すると、アクチンの「尾」と反対方向に小胞が運動することを発見し、その速度、方向変化などの画像解析を行った。アクチン重合阻害剤、チュブリン重合阻害剤などを使用後、この小胞運動がどのように影響されるかを検討した。 細胞内小胞運動は微小管に添う運動がよく知られているが、我々の見出した運動は微小管と関連なくアクチン重合による運動であることを証明した。PIP5Kの産物PIP2の上昇に伴い、低分子量G蛋白Rhoファミリーの作用でN-WASPが作用し、このC端VCAドメインがアクチン核形成因子Arp2/3コンプレックスを活性化するためアクチン重合が起こり、その推進力で小胞が前に押し出されることが判明した。
PIP5K発現により、リサイクリング小胞マーカーのトランスフェリンの細胞内動態に変化が見られた。
(3)PIP5Kと膜小領域との関係
PIP5Kが細胞膜小領域に局在する可能性を調べるため、コレステロール低下薬剤サイクロデキストリンを細胞に作用させると膜小領域が破壊されることを利用してPIP5K分布の変化を、カベオリンの分布も含め解析した。
(なお、本研究は、研究計画に変更が生じたものの、これは当初の研究目的を合理的に達成するためのものであり、研究成果を充分にあげることができたことを付記する。)