2004 Fiscal Year Annual Research Report
免疫電顕法を用いた小胞体-ゴルジ体間輸送装置の3次元的解析
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14580704
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| Research Institution | Nagahama Institute of Bio-Science and Technology |
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Principal Investigator |
山本 章嗣 長浜バイオ大学, バイオサイエンス学部, 教授 (30174775)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
柾木 龍一 関西医科大学, 医学部, 講師 (70140283)
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| Keywords | 3次元免疫電子顕微鏡法 / 小胞体 / ゴルジ体 / 小胞輸送 / 精子細胞 / GM130 / ミクロソーム型アルデヒド脱水素酵素 / p125 |
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| Research Abstract |
小胞体で合成された新生タンパク質は、小胞輸送によってそれが機能すべき目的地に運ばれる.小胞体からゴルジ体への輸送は、新生タンパク質の輸送の最初のステップとして、全ての小胞輸送系において極めて重要な位置を占めている.本研究では、小胞体ーゴルジ体間輸送の分子機構を明らかにすることを目的として、この輸送システムの3次元的構造を免疫電顕法を用いて解析することを試みた。そのため、細胞の包埋前に金コロイド・銀増感法を用いて、通常より厚い切片(〜250nm)を作製し、傾斜装置により立体写真の撮影、あるいは電顕トモグラフィーを行った。
1.精子細胞のゴルジ体の立体観察。ゴルジ期の精子細胞にはゴルジ体がよく発達してアクロソームの形成に関与する。ラット精巣を用いて、シスゴルジ体タンパク質のGM130を金コロイド・銀増感法を用いて検出し、250nm厚の切片を125kVの加速電圧で観察し電顕トモグラフィーを行った。その結果、精子細胞のシスゴルジ膜の細胞質面にGM130が局在することが明瞭に示された.
2.輸送小胞形成と小胞体膜タンパク質の残留機構。ミクロソーム型アルデヒド脱水素酵素の小胞体局在化シグナルはそのC末端35アミノ酸残基に存在する。このアミノ酸配列をC末にもつGFPを作製し(Masaki, Kameyama, Yamamoto. J.Biochem.134,415-426,2003)、COS細胞に発現させることによって、小胞体から輸送小胞が形成される際に、このキメラタンパク質が輸送小胞から排除され、小胞体に留まることを金コロイド・銀増感法による免疫電子顕微鏡法を用いて明らかにした.
3.輸送小胞形成に関与する新規タンパク質.Sec23と結合する新規タンパク質p125を見いだし、それが小胞体のexit siteに局在して、輸送小胞形成に働いていることを示した(東京薬科大学、生命科学部、多賀谷教授との共同研究)
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