日本で分離されたLCMウイルスの知見を基にした組換え抗原の検定と診断法への応用

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14580800
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 大沢 一貴 長崎大学, 先導生命科学研究支援センター, 助教授 (90244756)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 近藤 宇史 長崎大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 教授 (00158908) ; 片峰 茂 長崎大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 教授 (40161062) ; 佐藤 浩 長崎大学, 先導生命科学研究支援センター, 教授 (50072947)
• Keywords: LCMV / リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス / 診断用組換え抗原

Research Abstract

国内でもある港湾地区のマウスからリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)が分離され(OQ株)、プロトタイプであるWE株と遺伝子レベルでの比較検討がS遺伝子領域について行われてきた。OQ28株の塩基配列は、他の国内分離OQ株とは99%以上一致し、WE株と国内分離株とは大別されることが明らかとなった。そこで、日本国内においてLCMウィルスに感染したか否かを高感度、かつ特異的に診断するためには、国内分離株を用いた診断用抗原の作製の必要性が不可欠であると考え、国内分離株OQ28株を用いてタンパク発現を目指することとした。
1.発現用ベクター(pDsRed)に置換し、哺乳類細胞由来のCOS7細胞にトランスフォームした。OQ株のGp-2、Np-full、Np-Nend、Np-center Np-Cendを発現ベクターに置換し、トランスフォームの結果、Np-full、Np-Nend、Np-centerで赤色の蛍光を発する細胞を得たが、診断に耐えるだけの抗原量が得られなかった。
2.Np領域は、糖鎖による修飾を受けないため、大腸菌で発現させても抗原性を発揮する可能性が高いと考えられた。そこで、Np領域を3つに分割する断片をPCRによって作製し、それぞれの断片を発現用ベクターpGEX-6P-1に置換した。大腸菌DH5αにトランスフォームした後、シークエンスを行って3種類の断片が正確に発現ベクターに導入されていることを確認した。pGEX-6P-1はマルチクローニングサイトの上流にグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)をコードする領域をもつため、目的のタンパク質はGSTとの融合タンパク質として発現するので、このGSTを検出指標としたELISA法により、融合タンパク質の発現を確認した。

Research Products

• [Publications] Tamura: "Allogeneic Cell Stimulation Enhances Cytomegalovirus Replication in the Early Period of Primary Infection in an Experimental Rat Model"The Journal of Heart and Lung Transplantation. 22・4. 452-459 (2003)
• [Publications] Ohsawa: "Sequence and Genetic Arrangement of the UL Region of the Monkey B Virus (Cercopithecine herpesvirus 1) Genome and Comparison with the UL Region of Other Primate Herpesviruses"Archives of Virology. 148・4. 989-997 (2003)
• [Publications] Ohsawa: "Genetic Analysis of a Theiler-Like Virus Isolated from Rats"Comparative Medicine. 53・2. 191-196 (2003)
• [Publications] Tanaka: "Use of Herpesvirus papio 2 as an Alternative Antigen in immunoblotting assay for B virus Diagnosis"Journal of Veterinary Medical Science. (in press). (2004)