2002 Fiscal Year Annual Research Report
神経発生分化におけるカスパーゼの分子メカニズムの解明
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14599003
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| Research Institution | Gifu University |
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Principal Investigator |
中川 敏幸 岐阜大学, 大学院・医学研究科, 教授 (00271502)
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| Keywords | カスパーゼ / 神経細胞 / 神経分化 / アポトーシス / 細胞死 |
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| Research Abstract |
【目的】
アポトーシス関連遺伝子(カスパーゼ-3、-9、Apaf1)欠失ミュータントマウスおよび初代神経培養細胞の解析結果から、神経幹細胞を含む神経細胞の発達・分化の段階ではカスパーゼの活性化が必要であることを示唆している。すなわち、神経細胞分化時に活性化されるカスパーゼを同定し、その基質を探索する。さらに、その神経分化・再生機構への関与を証明し、アポトーシスにおいて中心的な役割を果たしているカスパーゼの新規の機構(分子メカニズム)を解明する。
【研究実績】
1.神経細胞分化時に発現するカスパーゼ:胎生13.5日齢のマウス胎児脳の神経初代培養での計時的なカスパーゼの発現をRT-PCRにて検討し、カスパーゼ-3およびカスパーゼ-7の発現を証明した。
2.カスパーゼ-3およびカスパーゼ-7を発現ベクターにクローニングし、大腸菌にて活性化型カスパーゼを作成した。
3.スモールプール脳cDNAライブラリーを使用し、in vitroカスパーゼ切断アッセイ法によるカスパーゼ基質の探索中である。すなわち、一つのプールが50-100個のコロニーで、independentなプラスミドライブラリーそれぞれのプラスミドからin vitro transcription ＆ translation法にて^<35>Sラベルした蛋白を作成し、in vitroカスパーゼ切断アッセイ法による基質のスクリーニングを行った。カスパーゼ処理前後のサンプルをSDS-PAGEにて電気泳動し、オートラジオグラフィーにてバンドの位置の変化からcDNAプール中での基質の存在を同定する。
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