RECQヘリカーゼファミリーのゲノム安定化機構における役割

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14654151
• Research Institution: Kyushu Institute of Technology
• Principal Investigator: 草野 好司 九州工業大学, 大学院・生命体工学研究科, 助教授 (70336098)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 尾川 博昭 九州工業大学, 大学院・生命体工学研究科, 教授 (50108685)
• Keywords: RECQファミリー蛋白 / 2本鎖DNA切断修復 / 減数分裂期組換え / 発生分化制御 / ヘリカーゼ

Research Abstract

我々はRECQファミリー蛋白が染色体をどのように安定維持しているかを知るために、大腸菌RecQと出芽酵母、ショウジョウバエ(Dm)のRECQ相同蛋白の遺伝学的・生化学的解析を行った。
(1)大腸菌RecQがMutSLHによるDNAミスマッチ修復経路で機能することを発見した。
(2)出芽酵母のSGS1(RecQ相同蛋白)が2本鎖DNA切断修復に関与していることを証明した。
(3)ショウジョウバエdmblm/mus309変異は、(a)減数分裂組換え頻度の低下、(b)雌不妊性のmeiW68変異導入による回復、(c)2本鎖切断点において、交叉あり遺伝子変換と近傍欠失の上昇が起こることを発見した。これらの研究成果よりBLM蛋白が2本鎖切断修復と減数分裂期組換えに関与することが分かった。dmrecQ4^<P104>変異は、(a)2齢幼虫期に致死を引き起こした。(b)この変異株内でdmrecQ4導入遺伝子P{hs70p-dmrecQ4}を幼虫期に発現させると、発生は正常に進み成虫に達した。(c)弱く発現させると25%の個体のみが成虫に達したが、眼の退縮と肢の彎曲といった発生異常が認められた。、(d)dmrecQ4^<P104>/P{hs70p-dmrecQ4}株の雌は、完全不妊性を示した。dmrecQ5^<del>変異は、dmrecQ4^<P104>変異株のような致死性を示さず、dmblm/mus309変異のように、MMSに対する著しい感受性のみを示した(4)DNAヘリカーゼ活性の測定:ショウジョウバエDmRecQ4蛋白とDmKu70蛋白をMBP融合蛋白として、アミロースカラム、DNAセルロースカラムの2段階を通して、精製した。FRET(蛍光共鳴エネルギー転移)の原理を利用して、donor/receptorであるFITC/Cy3を基質DNAの末端に標識させ、励起光を当てると、2本鎖状態ではdonorの蛍光はrqceptorによって吸収されるが、ヘリカーゼによってreceptor-相補鎖が巻き戻されると、donorは蛍光を発する系を作製した。実際に大腸菌UvrDヘリカーゼがFITC-単鎖からCy3-相補鎖を巻き戻すことを確認した。この系を用いて、DmrecQ4蛋白が平滑末端のDNA基質を巻き戻すことが分かった。

Research Products

• [Publications] Kusano K.: "Cell death promoted by homologous DNA interaction from bacteria to humans."Advances in Biophysics. 38. 81-96 (2004)
• [Publications] Kusano K., Asami Y., Fujita A., Tanokura M., Kobayashi I.: "Type I restriction, enzyme with RecA protein promotes illegitimate recombination."Plasmid. 50・3. 202-212 (2003)