2002 Fiscal Year Annual Research Report
タンパク質工学によるセリシン誘導体の創製,および構造と機能相関性の解明
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14656042
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| Research Institution | Fukui Prefectural University |
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Principal Investigator |
中森 茂 福井県立大学, 生物資源学部, 教授 (00254243)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
辻本 和久 セーレン株式会社, 開発研究第2部, 研究員
高橋 正和 福井県立大学, 生物資源学部, 助手 (80315837)
高木 博史 福井県立大学, 生物資源学部, 教授 (50275088)
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| Keywords | セリシンタンパク質 / タンパク質工学 / 組換えセリシン / カイコ幼虫 / 中部絹糸腺 / 反復配列 / 大腸菌による生産 |
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| Research Abstract |
カイコのセリシンタンパク質をコードする遺伝子ser1には9つのエクソンがあり、それぞれ、セリシンに特徴的なセリシンを多く含む38アミノ酸からなる反復配列がある。この反復配列がセリシンの機能性に重要な役割をもつと考え、これらを「組換えセリシン」として、この調製法を検討した。
1)カイコ5令幼虫の中部絹糸腺の細胞から調製したmRNAを材料にcDNAライブラリーを作成し、セリシン遺伝子に特異的なプローブを用いてPCRを行い、この中からser!BのcDNAをスクリーニングした。
2)得られたser!BのcDNAを鋳型にPCRを行って増幅し、反復配列部分を含む3種、つまり、2回の反復配列を含む分子量8.0kDa、それにヒスチジンタグをもつ9.0kDa、4回の反復配列を含む14.5kDa、の遺伝子断片を調製した。
3)これらの遺伝子断片を大腸菌の発現ベクター(pET)にクローニングし、形質転換して生産菌候補を得た。
4)得られた大腸菌をLB液体培地2lを用い、途上でIPTGを添加して27時間37℃で振とう培養し、菌体の可溶性画分から、SDS-PAG電気泳動でそれぞれの分子量に相当する位置に対応するバンドを得、目的とする「組換えセリシン」が生産されることを証明した。
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