胚性幹細胞を用いた心筋の構築:メダカ心筋分化誘導因子の精製と同定

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14657035
• Research Institution: Tokai University
• Principal Investigator: 津田 道雄 東海大学, 医学部, 助教授 (00102848)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 兵頭 昌雄 東海大学, 開発工学部, 教授 (60096253)
• Keywords: メダカ / 心筋細胞 / 分化誘導因子 / 胚細胞 / 心筋特異的転写因子 / 分化誘導因子の精製

Research Abstract

申請者はメダカ胞胚から胚性幹細胞の樹立を試みている途上で、長期継代培養を行っているメダカ細胞株の培養上清を胚細胞に添加したところ、多数の細胞が自律的に収縮する細胞へと分化することを見出し、この上清中に胚細胞から自律的に収縮する細胞を誘導する因子が存在することを発見した。平成14年度の研究は、(1)本因子により誘導された細胞が心筋細胞であることを遺伝子レベル、分子レベルで明確にする事(2)クローニングのために本因子を高度に精製することであった。
1.「分化誘導因子は心筋を誘導する」
心筋特異的転写因子の発現;心筋細胞特異的転写因子と考えられるGATA-4,MEF2CをRT-PCRを用いて発現を確認した。電子顕微鏡での心筋の繊維構造を確認するとともに、免疫組織染色法を用いて心筋特異的Troponin Iの発現を確認した。これらのことから本因子で誘導される自律的に拍動する細胞は心筋細胞であることが確定できた。
2.「分化誘導因子の精製」
分化誘導因子の精製材料は、メダカ胚より樹立した、心筋分化誘導因子を分泌している長期培養細胞株の培養上清を用い、硫安分画法、SP-Sepharose columnイオン交換カラム、ヒドロキシアパタイトカラム、Sephadex-G75ゲルろ過カラム、Heparin-Sepharoseを用いて精製を行った。
現在までに3%の回収率で、約8万倍にまで高度精製に成功している。平成15年度は高度精製標品のアミノ酸配列を決定し、クローニングを行い、本因子の同定を行う予定である。