特発性心筋症に対する遺伝子修正幹細胞を用いた細胞移植治療に関する基礎的研究

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14657159
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 白土 邦男 東北大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (80004761)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 加賀谷 豊 東北大学, 医学部附属病院, 講師 (90250779) ; 渡辺 淳 東北大学, 大学院・医学系研究科, 助教授 (90210905)
• Keywords: 遺伝子細胞治療 / 特発性心筋症

Research Abstract

平成14年度の研究実績を以下に述べる。
1、コントロールBioF1Bハムスターの心筋組織よりmRNAを抽出しcDNAを作成した。
2、このcDNA中よりヒトならびにマウスδサルコグリカンmRNAの既知の塩基配列の中で非常に良く保存されている塩基配列をプライマーとして5'ならびに3'の両端へのRACEを行い、cDNAを取得した。ハムスターδサルコグリカンcDNAの塩基配列を解析し、ヒトならびにマウスδサルコグリカンとの相同性を確認した。
3、一方、ハムスター肝臓より採取したハムスターゲノムDNAを取得し、ゲノムDNAフラグメント上にてcDNA塩基配列を用い遺伝子の5'端ならびに3'端に約500塩基対毎にPCR法にて増幅し、各々のフラグメントの塩基配列解析を行いδサルコグリカン遺伝子の5'端ならびに3'端の分析を行った。
4、2で作成したcDNAを制限酵素で切断し、FLAGをC端末に添加する発現ベクター中に挿入、ラージスケールで培養後抽出した。その後PCR法にて増幅後に塩基配列を確認した。このターゲッティングベクターを直線化した後に、通常の培養液中に浮遊させたコントロールハムスター骨髄単核細胞に対し電気穿孔法にて細胞内に導入し、選択培養液にて相同組み換えを起こした細胞のみを抽出する方法を試みているが、現時点では成功していない。
5、そこでFLAGをC端末に挿入し、かつ別個にGFPを発現するベクター中に挿入しラージスケールで培養後に抽出した。PCR法にて増幅後挿入塩基配列を確認した。このベクターをハムスター大腿骨骨髄より単離した骨髄単核細胞にリポフェクション法にて良好に導入する条件を策定中である。