2002 Fiscal Year Annual Research Report
変異m-RNAの選択能破壊による水泡型先天性魚鱗癬様紅皮症の新しい治療法の開発
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14657195
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
清水 宏 北海道大学, 大学院・医学研究科, 教授 (00146672)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
秋山 真志 北海道大学, 医学部附属病院, 講師 (60222551)
澤村 大輔 北海道大学, 大学院・医学研究科, 助教授 (60196334)
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| Keywords | 遺伝子導入 / 水疱型先天性魚鱗癬様紅皮症 / 魚鱗癬 / ケラチン / リポザイム |
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| Research Abstract |
1)in vitroの系でリボザイムによるm-RNAの切断の検討
ケラチンK1のmRNAにおけるリボザイムの最適切断部位を二次構造予測プログラムを用いて予想した。そこを切断するリボザイム発現ベクターを作成し、そのリボザイム発現ベクターを正常培養表皮細胞に導入し、m-RNAや蛋白レベルでのケラチン1の発現量の抑制を確認した。次に、患者m-RNAの変異部位のみ認識するようリボザイムを設計し、リボザイム発現ベクターを作成した。患者由来の表皮細胞にリボザイム発現ベクターを導入した後、m-RNAレベルでmutant alleleとwild type allele由来のm-RNA量を測定し、mutant alleleと由来のもののみ抑制されるのを確認した。
2)in vivoの系でリボザイムによるm-RNAの切断作用の検討 in vivoでのリボザイムによるK1 wild type mRNA切断効果を検討する目的で、ラットのK1mRNAを切断するようなリボザイム発現ベクターを同様の方法で設計した。リボザイム発現ベクターを、マーダージェットを用いたnaked DNA法でラットの皮膚に遺伝子導入した。導入部位の皮膚を生検し、K1のm-RNA及び蛋白の発現量の低下を確認した。
3)ヒト皮膚におけるリボザイムの効果の検討 ヌードラットにBCIE患者の皮膚を移植した。患者の変異をターゲットとしたリボザイムを発現するベクターをマーダージェットを用いたnaked DNA法にて遺伝子導入した。次に、mutant all eleとwild type allele由来のm-RNA量を測定し、また、移植皮膚の表現型の変化を観察した。
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[Publications] Akiyama M, et al.: "Formation of cornified cell envelope in human hair follicle development"Br J Dermatol. 146. 968-976 (2002)
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[Publications] Arita K, et al.: "Changes in gap junction distribution and connexin expression pattern during human fetal skin development"J Histochem Cytochem. 50. 1493-1500 (2002)
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[Publications] Sawamura D, et al.: "Direct injection of naked DNA and cytokine transgene expression : implications for keratinocyte gene therapy"Clin Exp Dermatol. 27. 480-484 (2002)
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[Publications] Sawamura D, et al.: "The majority of keratinocytes incorporate intradermally injected plasmid DNA regardless of size but only a small proportion of cells can express the gene product"J Invest Dermatol. 118. 967-971 (2002)
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[Publications] Yasukawa K, et al.: "Dominant and recessive compound heterozygous mutations in epidermolysis bullosa simplex demonstrate the role of the stutter region in keratin intermediate filament assembly"J Biol Chem. 277. 23670-23674 (2002)
