2002 Fiscal Year Annual Research Report
抗DNA抗体を用いたCD34陽性細胞への遺伝子導入
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14657238
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
佐々木 毅 東北大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (50110656)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石井 智徳 東北大学, 大学院・医学系研究科, 助手 (10282138)
宮村 耕一 東北大学, 医学部附属病院, 講師 (70323029)
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| Keywords | 造血幹細胞 / 抗DNA抗体 / 遺伝子導入 |
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| Research Abstract |
1.抗DNA抗体単鎖抗体発現系の作成
我々が樹立したヒトモノクロナル抗DNA抗体産生クロン0-81DNAより得てpUC19ベクターにてクローニングした0-81のVH及びVk遺伝子(0-81VHpUC19及び081V_K pUC19)を用いた。まず、081VKpUC19を基質として、081KFR1HindNot (5'-GAAAAGCTTGCGGCCGCTGATGTTGTGACTCAG-3')と081KFR41inkerBam (5'-ACCGGATCCTCCACCACCACTTCCACCTCCACCTCGTTTAATCTCCAGTCGTG-3')の2つのプライマーを用いてPCR法にてVk遺伝子を増幅した。増幅されたDNA断片を制限酵素HindIIIとBamHIで切断し、これをPinPoint^<TM>Xa-1 vector (Promega)のマルチクローニングサイト(MCS)の同じ制限酵素部位に挿入した(081VKPinPointXa 1)。次に、081VHpUC19V_Hを基質として081HFRlinkerBgl (5'GGAAGATCTGGTGGAGGTGGATCAGAGGTGCAGCTGGTGGAG-3')と081HFR4Bam (5'-GTTGGATCCTTATGAGGAGACGGTGACCAG-3')の二つのプライマーを用いてPCR法にて081V_H遺伝子を増幅した。増幅されたDNA断片を制限酵素BgIIIとBamHI Iで切断し、081VKPinPointX 1のBamHIサイトに挿入した(081scFvPinPointXal)。この081scFvPinPointXalにて大腸菌JM109株を形質転換し、LB培地にて大量培養した。PinPoint^<TM> Xa Protein Purification System (Promega)を用いて産生された081scFvを精製した。
2.0-81scFVについてDNA及び抗DNA抗体に対する抗イディオタイプ抗体DIE2との反応性を検討したところ、いづれとも特異的に結合しうることを確認した。これより0-81scFVが遺伝子(DNA)と結合してCD34陽性細胞への遺伝子挿入する戦略の第一段階ができた。
3.現在、上記の0-81scFV遺伝子にプロティン遺伝子を付加した発現系、抗CD34単鎖抗体遺伝子にTaq遺伝子を付加した発現系を構築中である。
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[Publications] T.Saito, Y.Munakata, T.Sasaki et al.: "Evalution of anti-parvovirus B19 neautralizing activity by quantitative polymerase chain-reaction-based assay"J. vivological Method. 107. 81-87 (2003)
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[Publications] Hirabayashi, S.Saito, T.Sasaki et al.: "Mononeuritismultiplex, protein-losinggastroenteropathy and chroldopathy seen together in a case systemic lupus erythematosus"Modern Rheumatology. (in press). (2003)
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[Publications] Minami, T.Sasaki, S.Hisamichi, et al.: "Dietary factors in relation to clinical manifestations of systemic lupus erythematosus"Journal of Rheumatology. (in press). (2003)
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[Publications] Y.Minami, T.Sasaki, Y.Arai et al.: "Lupus Study Group : Psychological Profiles and Health Status in Japanese Female Patients with Systemic Lupus Erythematosus"Journal of Epidemiology. 12. 55-63 (2002)
