インテグリン発現に基づいた消化管Stem Cells同定・分離のための基盤的研究

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14657307
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 藤本 康二 京都大学, 医学研究科, 助手 (70335280)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 土井 隆一郎 京都大学, 医学研究科, 講師 (20301236) ; 今村 正之 京都大学, 医学研究科, 教授 (00108995)
• Keywords: 大腸 / Stem cells / β1インテグリン / Crypt / Soft agar

Research Abstract

大腸Stem cellsのマーカー分子を同定するため、細胞外基質に対する受容体であるインテグリン分子に着目し、以下のような研究戦略に基づき実験をおこなった。
1.ヒト正常大腸組織(crypts)におけるインテグリン分子の発現をその局在に注目し検討した。十分なインフォームド・コンセントを患者およびその家族より得た上で、大腸癌手術時に得られる大腸摘出材料を用いて正常大腸組織凍結切片を作成した。12種類のα及びβインテグリン抗体による免疫蛍光組織染色を施行し、cryptsにおけるインテグリンの発現分布を検討した結果、β1インテグリンがStem cellsが存在するといわれているcrypt底部に強発現していることを見出した。
2.Flow cytometryにより、正常大腸上皮細胞(crypt cells)におけるインテグリン発現を解析した。上記と同様の方法にて得られた正常大腸組織粘膜をEDTA/DTT及びpancreatinを用いてsingle cellsの状態に分離後(Whitehead et al.,Gastroenterology 117(4):858-865,1999)、インテグリン抗体を用いて蛍光免疫細胞染色をおこない、flow cytometryによりインテグリンの発現様式を解析した。Stem cellの存在するcryptsの底部付近にのみ強発現するβ1インテグリンにおける解析では、2峰性のピーク(インテグリン強発現群と低発現群)が認められ、強発現群の細胞がStem cellsが存在するといわれているcrypt底部から分離された細胞集団である可能性が推測された。
3.上記1,2で確認したStem cellsに特異的なβ1インテグリン発現に基づいて正常大腸組織粘膜からsingle crypt cellsを分離後、蛍光免疫細胞染色し、β1インテグリン強発現細胞のみをsortingした。この細胞集団を用いてsoft agarによるcolony assayによりコロニー形成能を観察しclonogenic potentialを評価した。β1インテグリン発現に基づいてsortingされた細胞群におけるコロニー形成能は、sortingされていない細胞群(control)に比し、有意に高かった。
以上より、β1インテグリンは大腸Stem cellsのマーカー分子となり得る可能性が示唆された。

Research Products

• [Publications] Koji Fujimoto et al.: "Identification and Isolation of Candidate Human Colonic Clonogenic Cells Based on Cell Surface Integrin Expression."Gastroenterology. 123. 1941-1948 (2002)
• [Publications] Koji Fujimoto et al.: "p53, p21^<WAF1/CIP1>, and Ras involvement in proliferation in conditionally immortalized pancreatic epithelial cells."Pancreas. 25・4. 428 (2002)
• [Publications] Koji Fujimoto et al.: "Oncogenic Ras and p53 inactivation synergistically lead to acquisition of anchorage-independent growth through the disruption of G2/M arrest in conditionally Immortalized pancreatic epithelial cells."Annals of Surgical Oncology. 10・1. S22 (2003)
• [Publications] Daisuke Ito et al.: "Chronic exposure of Transforming growth factor-beta 1, confers a more aggressive tumor phenotype through downregulation of p21^<WAF1/CIP1> in conditionally immortalized pancreatic epithelial cells."Surgery. In press.
• [Publications] 藤本康二ら: "膵癌に対する化学療法指針"外科. 65・11. 1260-1264 (2003)