2002 Fiscal Year Annual Research Report
ジスルフィド結合で閉じた小ループの導入による系統的なタンパク質の高機能化戦略
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14657593
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
栗本 英治 名古屋市立大学, 大学院・薬学研究科, 助手 (90234575)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
加藤 晃一 名古屋市立大学, 大学院・薬学研究科, 教授 (20211849)
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| Keywords | protein / disulfide bond / stability / protein disulfide isomerase / circular dichroism / mutation |
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| Research Abstract |
今年度はprotein disulfide isomerase(PDI)、parkinを取り上げ、以下の結果を得た。
1.好熱カビPDIは二つの活性部位の他に分子内部に小ループ形成ジスルフィド(S-S)結合を一つ持つ。PDIの酸化的リフォールディング過程では分子内部のS-S結合が優先的に形成され、それにより熱安定性・活性が高まる。この分子内部のS-S結合の形成・還元が全体的な構造にどのように影響するかを調べるため、システイン残基を^<13>Cで選択的に標識したPDIを大量調製し、NMR解析を行った。その結果、小ループの開裂が同ドメイン内に存在する活性部位の構造に変化をもたらすことが原子レベルで明らかとなった。
2.好熱カビPDIの分子内部のS-S結合はaドメインにあるが、それと相同なa'ドメインには相当するS-S結合が存在しない。そこで、a'ドメインにこれと対応するS-S結合の導入を行った。用いた変異体は[A398→C、P404→C]、[A398→C、D405→C]などの二重置換がなされたものである。これらの小ループ導入変異型PDIについて、S-S結合形成の確認、及びCDスペクトル測定による熱安定性測定などの実験が現在進行中である。
3.小ループ導入の対象タンパク質として、パーキンソン病の原因物質であるparkinを取り上げた。^<13>C、^<15>Nで二重標識したparkinのubiquitin-likeドメインを大腸菌を用いて多量に調製し、多次元NMR法によりその3次元構造を決定した。これにより、小ループ導入の候補となる部位を的確に選択することが可能になった。
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