環境発がん物質活性化に関わる哺乳類ニトロ還元酵素の機能と構造

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14658157
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 善野 修平 東京大学, 大学院・理学系研究科, 助手 (90313204)
• Keywords: 発がん物質 / ニトロ化合物 / ニトロ還元酵素 / フラビン酵素 / 環境発がん

Research Abstract

平成14年度は、ヒトとマウスのニトロ還元酵素候補の完全長cDNAのクローニングを行なった。文献やデータベースの検索から、哺乳類ニトロ還元酵素の候補として、DT-ジアホラーゼ(NQO1)、DT-ジアホラーゼ2(NQO2)、細菌ニトロ還元酵素ホモログ(NTR)、酸化還元ニトロドメイン含有蛋白質(NOR1)の4つが見い出された。ゲノムDNAとcDNAの配列データベース情報を基に、ニトロ還元酵素候補遺伝子の開始コドンをコザック配列と5'-非翻訳領域のインフレーム終止コドンの存在から決定し、完全長cDNAを大腸菌発現ベクターに直接クローニングできるようにRT-PCRプライマーを設計し、N-末端6xHisタグ融合蛋白質のpET発現系を構築した。この際、ヒトに関してはHeLa培養細胞、マウスに関してはNIH3T3培養細胞のRNAをRT-_<PCR>の鋳型として用いた。得られた発現プラスミドを大腸菌レアコドンtRNAを過剰発現する宿主BL21(DE3)-CodonPlus-RILに導入して、各々の6xHis融合蛋白質の発現を検討した。その結果、NQO1、NQO2に関してはある程度の発現量(〜10mg/L培養液)は確認できたものの、NTR、NOR1の発現は確認できなかった。一方、NTRとFOR1の配列決定から、ヒトNTRは289アミノ酸、マウスNTRは285アミノ酸から成り、NOR1はヒト、マウスとも379アミノ酸から成ることが分かった。ヒト酵素とマウス酵素のアミノ酸相同性は、NTRで86%、NOR1で81%であった。今後、NTRとNOR1に関して、バキュロウイルス系による発現を検討する。

Research Products

• [Publications] Masahiro Sakurai: "Identification of possible substrate-specificity deternimants in NfsA, the major oxygen-insensitive nitroreductase from Escherichia coli"Flavins and Flavoproteins. (in press). (2003)
• [Publications] Woo Cheol Lee: "Crystallographic analysis of flavin oxidoreductase from Helicobacter pylori responsible for its susceptibility to antibiotic metronidazole"Flavins and Flavoproteins. (in press). (2003)
• [Publications] Noboru Doi: "Short-interfering-RNA-mediated gene silencing in mammalian cells requires Dicer and eIF2C translation initiation factors"Current Biology. 13・1. 41-46 (2003)
• [Publications] 程久美子: "哺乳類培養細胞でのsiRNAによるRNAiプロトコル"細胞工学. 21・9. 1058-1061 (2002)
• [Publications] 上田龍: "ショウジョウバエのRNAiプロトコル(誘導型RNAi)"細胞工学. 21・8. 931-940 (2002)
• [Publications] 程久美子: "RNAiによる逆遺伝学、新タンパク質科学実験法"大島泰郎・藤井義明・村松・喬 編、東京化学同人(印刷中). (2003)