環境発がん物質活性化に関わる哺乳類ニトロ還元酵素の機能と構造

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14658157
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 善野 修平 東京大学, 大学院・理学系研究科, 助手 (90313204)
• Keywords: ニトロ還元酵素 / 環境発がん物質 / フラビン蛋白質 / NAD(P)H / フラビン / ニトロ化合物

Research Abstract

平成15年度は、新規の哺乳類ニトロ還元酵素候補である細菌ニトロ還元酵素ホモログ(NTR)、酸化還元ニトロドメイン含有蛋白質(NOR1)のヒト及びマウス蛋白質について解析した。先ず、cDNAをプローブとして、ヒトHeLa細胞とマウスNIH3T3細胞のポリA+RNAに対してノザンブロット解析した。NTRで1.0kb、NOR1で1.3kbの転写産物を検出し、それらはcDNAサイズとほぼ一致した。次に、NTRとNOR1のGST融合発現系(宿主はBL21(DE3)-CodonPlus-RILを使用)を検討した。NTR、NOR1ともGST融合蛋白質として、〜10mg/L培養液の可溶性発現が可能であったが、不溶性画分にも発現蛋白質は見い出された。これらの可溶性画分から、発現蛋白質をアフィニティ精製したが、幾つかの分解産物が含まれていた。この問題を解決すべく、さらにc末端に6xHisタグを融合した蛋白質を発現するコンストラクトを構築した。室温で培養した目的蛋白質を発現するBL21(DE3)-CodonPlus株から、目的蛋白質をGSTタグ精製後、6xHisタグ精製し、NTR及びNOR1を各々64kDa及び75kDaの融合蛋白質として得た。得られた精製蛋白質について、ニトロ化合物に対する反応性を試験したところ、NTRに関してはNADHとNADPHの両方を電子供与体とし、ニトロフラゾン等のニトロ発がん物質を還元分解できる活性を有していたが、NOR1に関してはニトロ化合物を還元する活性は見い出せなかった。

Research Products

• [Publications] Furukawa, H., Zenno, S.Iwasawa, Y., Morita, H., Yoshida, T., H., Nagasawa, T.: "Ferulic acid production from clove oil by Pseudomonas fluorescens E118"J.Biosci.Bioeng.. 96・4. 404-405 (2003)
• [Publications] Ui-Tei, K., Ueda, R., Zenno, S., Takahashi, F., Doi, N., Naito, Y., Yamamoto, M., Hashimoto, N., Takahashi, K., Hamada, T., Tokunaga, T., Saigo, K.: "RNA interference induced by transient or stable expression of hairpin structures of double stranded RNA in Drosophila and mammalian cells."Mol.Biol.. (in press). (2003)
• [Publications] 土井昇, 善野修平, 程久美子, 西郷薫: "siRNAによるRNAiの機構"遺伝子医学. 17・3. 322-327 (2003)
• [Publications] 程久美子, 善野修平, 西郷薫: "培養細胞でのsiRNAによるRNAi法,新遺伝子工学ハンドブック"村松正實・山本雅編,羊土社. 4 (2003)