小胞体での糖タンパク生合成における膜間オリゴ糖輸送機構の解明

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14658198
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 古山 種俊 東北大学, 多元物質科学研究所, 教授 (20089808)
• Keywords: フリッパーゼ / フリップ-フロップ / ファルネシル二リン酸 / ウンデカプレニル二リン酸 / 糖タンパク質生合成 / ドリコールリン酸 / プレニルトランスフェラーゼ / ポリプレノール

Research Abstract

真核生物の糖タンパク生合成において粗面小胞体の細胞質ゾル側で生合成されたコアオリゴ糖成分をフリップ-フロップ移送によりルーメン側に輸送する動的な過程に関与するとされ、教科書にも記述されているにもかかわらず、全く実体が把握されていない酵素「フリッパーゼ」の酵素活性測定法の確立のために、蛍光プローブの合成法を検討した。まず、ルーメン側でタンパク質にオリゴ糖を転移させた後の担体脂質の回収過程、すなわちドリコールのフリップ-フロップ現象をターゲットにしたプローブとして、蛍光ラベルしたポリプレノールの合成を行った。この蛍光性プローブを用いて、人工的に調製したリポソームの二重膜中でのフリップ-フロップ現象の定量的測定法の確立のための条件検討を行った結果、ジチオナイトによってリボソームの外膜側の蛍光を消光し、蛍光プローブ量の変化を定量化する簡便な測定法が確立できた。
一方、細菌の細胞壁生合成において、細胞質側で生合成されたオリゴ糖鎖をフリップ-フロップ移送により細胞外膜側に輸送する動的な過程に関与するフリッパーゼの酵素活性測定法の確立のために、ウンデカプレニルリン酸の蛍光剤修飾体を合成し、大腸菌の内膜タンパク質を含有するリン脂質のリボソームを用いたウンデカプレニルリン酸のフリッブ-フロップ転移活性の定量化を行う系が確立出来た。
ヒトのデヒドロドリキルニリン酸合成酵素のcDNAをクローン化し、発現系の構築に成功した。これにより、ヒトの糖タンパク生合成のフリッパーゼ関連遺伝子の探索研究の手がかりを得ることが出来た。

Research Products

• [Publications] M.Nagaki, H.Yamamoto, A.Takahashi, Y.Maki, J.Ishibashi, T.Nishino, T.Koyama: "Substrate Specificity of Thermostable Farnesyl Diphosphate Synthase with Respect to 4-Alkyl Group Homologs of Isopentenyl Diphosphate"J. Mol. Catal. B : Enzymatic. 17・2. 81-89 (2002)
• [Publications] Y.Maki, M.Komabayashi, Y.Gotoh, N.Ohya, H.Hemmi, K.Hirooka, T.Nishino, T.Koyama: "Dramatic Changes in the Subustrate Specificities of Prenyltransferases by a Single Amino Acid Substitution"J. Mol. Catal. B : Enzymatic. 19-20. 431-436 (2002)
• [Publications] 槙 雄二, 長岐正彦, 西野徳三, 古山種俊: "有機合成におけるイソプレノイド生合性関連酵素:酵素機能改変と炭素-炭素結合形成ツールとしての有用性と展望"有機合成科学協会誌. 60・8. 783-793 (2002)
• [Publications] A.Takaya, Y.-W.Zhang, K.Asawatreratanakul, D.Wititsuwanakul, R, Wititsuwannakul, S.Takahashi, T.Koyama: "Cloning, Expression and Characterization of a Functional cDNA Clone Encoding Geranylgeranyl Diphosphate Synthase of Hevea brasiliensis"Biochim. Biopohys. Acta.. 1625・2. 214-220 (2003)
• [Publications] S.Endo, Y.-W.Zhang, S.Takahashi, T.Koyama: "Identification of Human Dehydrodolichyl Diphosphate Synthase Gene"Biochim. Biophys. Acta. 1625・3. 291-295 (2003)
• [Publications] Y.Kharel, T.Koyama: "Molecular Analysis of cis-Prenyl Chain Elongating Enzymes"Natural Product Reports. 20・1. 111-118 (2003)
• [Publications] S.Takahashi, T.Nishino, T.Koyama: "Isolation and Expressing of Paracoccus denitrificans Decaprenyl Diphosphate Synthase Gene for the Production of Ubiquinone-10 in E. coli"Biochem. Engineering J.. (印刷中).
• [Publications] M.Nagaki, K.Kuwahara, K.Kimura, J.Kawakami, Y.Miki, S.Ito, N.Morita, T.Nishino, T.Koyama: "Substrate Specificities of Medium-Prenylchain Elongating Enzymes, Hexaprenyl-and Heptapreny Diphosphate Synthases"J. Mol. Catal. B : Enzymatic. (印刷中).
• [Publications] K.Fujikura, Y.-W.Zhang, M.Fujihashi, M.Miki, T.Koyama: "Mutational Analysis of Allylic Substrate Binding Site of Micrococuus luteus B-P26 Undecarenyl Diphosphase Synthase"Biochemistry. (印刷中).