小胞体での糖タンパク生合成における膜間オリゴ糖輸送機構の解明

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14658198
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 古山 種俊 東北大学, 多元物質科学研究所, 教授 (20089808)
• Keywords: ウンデカプレニル二リン酸 / ファルネシル二リン酸 / プレニルトランスフェラーゼ / ドリコール / ポリプレノール / フリップ-フロップ / 糖タンパク生合成 / 細胞壁生合成

Research Abstract

ヒトの糖タンパク生合成における糖担体脂質、ドリコールの生合成前駆体合成に関与するデヒドロドリキル二リン酸合成酵素のcDNAクローニングを行い、酵母系での発現系の構築に成功した。この遺伝子産物に直接特異的に相互作用するタンパク質を酵母系ツーハイブリッドシステムを用いて探索した結果、いつくかの候補タンパク質が同定されたが、ヒトのニーマン・ピック病に関連するNPC-2タンパクもデヒドロドリキル二リン酸合成酵素と特異的相互作用を示すことが明らかになった。
「フリッパーゼ」の酵素活性測定法の確立のために、蛍光ラベルしたポリプレノールリン酸の合成を行い、この蛍光性プローブを用いて人工的に調整したリン脂質のリポソームでのポリプレノールリン酸の物理的拠動を追究した結果、ジチオナイトによってリポソームの外膜側の蛍光を消光し、蛍光プローブ量の変化の定量化を確立する過程で、ポリプレノールの炭素鎖長によってリン脂質膜内へのポリプレノール部の挿入状態が異なっていることが示唆された。
植物のデヒドロドリキル二リン酸合成酵素のcDNAクローニングをパラゴムノキやシロイヌナズナについて行い、天然ゴムを産生する植物と産生しない植物における糖担体脂質、ドリコールの生合成と天然ゴム生合成への生理的関与の差異を見いだすことが可能になった。
細菌の糖担体脂質ウンデカプレニルリン酸の生合成前駆体合成に関与するウンデカプレニル二リン酸合成酵素を用いて部位特異的変異導入実験を詳細に行った結果、シス型プレニル鎖延長酵素の生成物のプレニル鎖延長反応停止機構を解明することができた。

Research Products

• [Publications] S.Takahashi: "Isolation and Expression of Paracoccus denitrificans Decaprenyl Diphosphate Synthase Gene for the Production of Ubiquinone-10 in E.coil"Biochem.Engineering J.. 16・2. 183-190 (2003)
• [Publications] A.Takaya: "Cloning, Expression and Characterization of a Functional cDNA Clone Encoding Geranylgeranyl Diphosphate Synthase of Hevea brasiliensis"Biochim.Biophys.Acta. 1625・2. 214-220 (2003)
• [Publications] Shota Endo: "Identification of Human Dehydrodolichyl Diphosphate Synthase Gene"Biochim.Biophys.Acta. 1625・3. 291-295 (2003)
• [Publications] M.Nagaki: "Substrate Specificities of Medium-Prenylchain Elongating Enzymes, Hexaprenyl- and Heptaprenyl Diphosphate Synthases"J.Mol.Catal., B : Enzymatic. 22. 97-103 (2003)
• [Publications] Keitaro Fujikura: "Mutational Analysis of Allylic Substrate Binding Site of Micrococcus luteus B-P 26 Undecaprenyl Diphosphate Synthase"Biochemistry. 42・14. 4035-4041 (2003)
• [Publications] Y.Kharel: "Significance of Highly Conseved Aromatic Residues in Micrococcus luteus B-P 26 Undecaprenyl Diphosphate Synthase"J.Biochem.. 134・6. 819-826 (2003)
• [Publications] Kasem Asawatreratanakul: "Molecular Cloning Expression and Characterization of cDNA Encoding cis-Prenyltransferases from Hevea brasiliensis - A key factor participating in natural rubber biosynthesis"Eur.J.Biochem.. 270. 4671-4680 (2003)
• [Publications] Y.Kharel: "Molecular Analysis of cis-Prenyl Chain Elongating Enzymes"Natural Product Reports. 20・1. 111-118 (2003)
• [Publications] 高橋征司: "プレニル鎖延長酵素の遺伝子解明研究から見た天然ゴム生合成の分子解析"日本ゴム協会誌. 76・12. 446-452 (2003)