マトリックスメタロプロテイナーゼ-7の構造と機能の分子論的解析および阻害剤の開発

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14658203
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 井上 國世 京都大学, 農学研究科, 教授 (10223249)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 滝田 禎亮 京都大学, 農学研究科, 助手 (70263126) ; 榊 利之 京都大学, 農学研究科, 助教授 (70293909)
• Keywords: メタロプロテアーゼ / 金属酵素 / 細胞外マトリックス / カテキン / リグナン / 酵素阻害剤 / ガン転移 / 化学修飾

Research Abstract

マトリックスメタロプロテイナーゼ7(MMP7)の大腸菌内での発現とインクルージョンボディ(IB)からの再生を検討した。IBからのプロ体の再生法とプロ体から活性型酵素への変換について条件検討したが、水銀剤を用いる活性化より優れた活性化法は見出せなかった。MMP7の活性解離基を分子活性、ミカエリス定数のpH依存性から検討し、Tyr219の関与が推定された。従来、ZnプロテアーゼではGluあるいはZnに配位した水がペプチド基質への求核攻撃に関与すると考えられてきたが、本研究はTyrの関与を強く示唆した。MMP7活性のpH依存性は典型的なベル型を示し、その活性域はpH5-10である。本酵素の8個のTyrを段階的にニトロ化し、酵素活性のpH依存性に対する効果を検討した。2個のTyrをニトロ化してもpH依存性に大きな変化はないが、4-5個ニトロ化すると、酸性側でのみ活性が大きく減少し、ベル型のpH依存性が崩れ、非対称性の依存性を示した。ベル型からはずれるpH依存性を示す酵素の例は極めて稀であり、本研究ではニトロ化によりベル型からはずれる酵素を得ることができた。ニトロ化Tyrのアミノ化により再度ベル型を示したことから、ニトロ化による負電荷の導入がこのような変化を引き起こしたものと判断された。MMP7の活性を各種ポリフェノール類が阻害することを見出した。緑茶カテキンのうちECG,EGCGが強い阻害を示し、その阻害は非拮抗型であった。一方、14種類のリグナンを用いて阻害に関する構造活性相関を検討した。これらの成果は新規のMMP7阻害剤の開発のための基礎的知見を提供した。

Research Products

• [Publications] T.Sakaki, N.Sawada, K.Inouye他7名: "Metabolism of 26,26,26,27,27,27-F6-12,25-dihydroxyvitamin D3 by CYP24"Biochemical Pharmacology. (印刷中). (2003)
• [Publications] T.Takita, M.Nakagoshi, K.Inouye, B.Tonomura: "Lysyl-tRNA syntherase from Bacillus stearothermophilus"Journal of Molecular Biology. 325. 677-695 (2003)
• [Publications] 小根田洋史, 井上國世: "その活性がベル型からはずれたユニークなPH依存性を示す2,3の酵素の例と機能調節"化学と生物. 41(印刷中). (2003)
• [Publications] H.Oneda, M.Shiihara, K.Inouye: "Inhibitory effects of green tea catechins on the activity of human matrix ・・・"Journal of Biochemistry. 133(印刷中). (2003)
• [Publications] 小根田洋史, 井上國世: "α-アミラーゼの工業利用の現状"バイオインダストリー. 19・11. 8-11 (2002)
• [Publications] K.Inouye, K.Nagai: "Biochemical trials for expanding the utility of soy proteins"Sugiyama Chemical and Industrial Laboratory Annual Report. 2002. 43-59 (2002)
• [Publications] K.Nakamura, T.Suzuki, K.Inouye他4名: "Evaluation and application of a new dye affinity adsorbent"Journal of Chromatography A. 972. 21-25 (2002)
• [Publications] T.Takita, K.Inouye: "Transition state stabilization by the N-terminal anticodon-binding domain・・"Journal of Biological Chemistry. 277. 29275-29282 (2002)
• [Publications] A.Tanaka, H.Sugimoto, K.Inouye他4名: "Differential scanning calorimetry of the effects of Ca^<2+> on the thermal・・・"Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 67. 207-210 (2003)
• [Publications] Y.Muta, K.Inouye: "Inhibitory effects of alcohols on thermolysin activity・・・"Journal of Biochemistry. 132. 945-951 (2002)
• [Publications] R.Shinkyo, T.Sakai, K.Inouye他1名: "Metabolic pathways of dioxin by CYPIAI"Anchives of Biochemistry and Biophysics. 409. 180-187 (2003)
• [Publications] T.Sakaki, R.Shinkyo, K.Inouye他2名: "Biodegradation of polychlorinated divenzo p-dioxins by recombinant・・・"Archives of Biochemistry and Biophysics. 401. 91-98 (2002)
• [Publications] K.Inouye, K.Nagai, T.Takita: "Coagulation of soy protein isolates induced by subtilisin Carlsberg"Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50. 1237-1242 (2002)
• [Publications] K.Inouye, I.Ueno他2名: "Development of a synchronous enzyme-reaction system for a highly sensitive・・・"Journal of Biochemistry. 131. 97-105 (2002)
• [Publications] K.Inouye, R.Shinkyo他3名: "Metabolism of polychlorinated dibenzo-p-dioxins (PCDDS) by human・・・"Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50. 5496-5502 (2002)
• [Publications] K.Inouye, M.Shiihara他2名: "Deodorization of soybean proteins by enzymatic and physicochemical・・"Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50. 1652-1658 (2002)
• [Publications] 井上國世, 小根田洋史: "バイオサイエンス系の機器分析"三共出版(印刷中). (2003)
• [Publications] 井上國世: "酵素ハンドブック(第3版)"朝倉書店(印刷中). (2003)
• [Publications] K.Inouye: "Handbook of Food Enzymology"Marcel Dekker. 1108 (2003)