全真核細胞に適用可能な新規遺伝子被壊法の開発

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14658220
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 関 政幸 東北大学, 大学院・薬学研究科, 助教授 (70202140)
• Keywords: Xenopus Eggs Extract / RAD51 / RAD54 / ノックアウト / RPA

Research Abstract

本研究では、全ての真核細胞が内在的に有する相同組換え能を利用して、新規遺伝子破壊法を確立することを目的としている。具体的な達成目標は、試験管内で様々に加工を加えた二本鎖DNA/組み換えタンパク質RAD51を調製し、それを核の標的遺伝子座にターゲットインテグレーションさせることである。但し、実際には体細胞の核ではなく、カエル精子をアフリカツメガエルの卵抽出液中で反応させて構築した核を標的とした。この方法の利点は全ての反応は試験管内で完結することである。本年度は、1)再構成した核が相同組み換え修復能を持つか?2)カエルのRAD51タンパク質の調製。以上、2点について検討を行った。1)に対しては、EcoRIを核に加えてDNAに二重鎖切断(DSB)を導入したところ、DSBの近辺のヒストンH2AXがリン酸化され、RPAタンパク質が集積し、さらにRAD51タンパク質が精子核にリクルートされることを試験管内ではじめて再現した。さらにRAD51が集積している近辺でgemininに耐性のDNA合成、すなわちDNA修復合成活性を見いだした(Kobayashi et al.,J. Cell Sci.,2002)。従って、試験管内で再構成した核が十分にDNA相同組み換え修復能を有していた。2)では、タグなしのカエルRAD51を大腸菌に発現させると、可溶性画分に発現するが、その精製にトラブルが生じた。一方HisタグRAD51は発現するが、不溶性画分にいってしまった。1年間苦労を重ねてようやくタグ付きRAD51を16度で培養することにより、可溶性画分にタンパク質を回収する条件を見いだした。次年度に向けて早急にRAD51タンパク質の大量精製を行う予定である。なお、ターゲッティング用のベクターは上記実験と平行して調製しつつある。次年度の早期にこれら全ての材料の調製を終了し、研究課題の目的にかなう実験を行う。

Research Products

• [Publications] Onodera, R., Seki, M., Ui, A., Satoh, Y., Miyajima, A., Onoda, F., Enomoto, T.: "Functional and physical interaction between Sgs1 and Top3 and Sgs1-independent function of Top3 in DNA recombination repair"Gen. Genet. Syst.. 77. 11-21 (2002)
• [Publications] Kobayashi, T., Tada, S., Tsuyama, T., Morohushi, M., Seki, M., Enomoto, T.: "Focus-formation of replication protein A, activation of checkpoint system and DNA repair synthesis induced by DNA double-strand breaks in cell-free extract derived from Xenopus eggs"J. Cell. Sci.. 115. 3159-3169 (2002)
• [Publications] Branzei, D, Seki, M., Onoda, F., Enomoto, T.: "The product of Saccharomyces cerevisiae WHIP/MGS1, a gene related to replication factor C genes, interacts functionally with DNA polymerase δ"Mol Genet Genomics.. 268. 371-386 (2002)
• [Publications] Hayashi, T., Seki, M., Maeda, D., Wang, W., Kawabe, T., Seki, T., Saitoh, H., Fukagawa, T., Yagi, H., Enomoto, T.: "Ubc9 is essential for viability of higher eukaryotic cells"Exp Cell Res.. 280. 212-221 (2002)
• [Publications] Branzei, D, Seki, M., Onoda, F., Yagi, H., Kawabe, Y., Enomoto, T.: "Characterization of the slow-growth phenotype of S. cerevisiae whip/mgs1 sgs1 double deletion mutants"DNA Repair. 1. 671-682 (2002)
• [Publications] Odagiri, N., Seki, M., Onoda, F., Yoshimura, A., Watabane, S., Enomoto T.: "Budding yeast mms4 is epistatic with rad52 and the function of Mms4 can be replaced by a bacteria Holliday junction resolvase"DNA repair. 2. 347-358 (2003)
• [Publications] Wang, W., Seki, M., Narita, Y., Nakagawa, T., Yoshimura, A., Otsuki, M., Kawabe, Y., Tada, S., Yagi, H., Ishii, Y., Enomoto, T.: "Functional relation among RecQ family helicases, RecQL1, RecQL5, and BLM in cell growth and SCE formation"Mol. Cell. Biol.. (in press).