分子進化工学を用いたチロシルtRNA合成酵素のアミノ酸特異性のスイッチング

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14704067
• Research Institution: Gifu University
• Principal Investigator: 横川 隆志 岐阜大学, 工学部, 助教授 (90242304)
• Keywords: 非天然アミノ酸 / orthogonal tRNA / アミノアシルtRNA合成酵素 / ミスアミノアシル化 / 分子進化工学 / アジドチロシン / 部位特異的修飾 / フェニルアラニン

Research Abstract

アミノアシルtRNA合成酵素(aaRS)遺伝子を部位特異的に改変する手法では、酵素のアミノ酸特異性が劇的に変換されたような酵素を得ることは難しいと考えられる。昨年度、分子進化工学的手法の有効性を明らかにするためにorthogonalなサプレッサーtRNAが大腸菌の生細胞を用いて選別できるかを試みた。その結果、ミスアミノアシル化がほとんど認められないtRNA変異体が複数選別されてきたが、in vitroタンパク質合成活性を調べると、いずれの変異体もタンパク質合成にほとんど参加できないtRNA変異体であることがわかった。この結果は、生細胞を用いて目的の変異体を得る場合は、その選別戦略を相当練り上げないと、目的とする変異体が得られないという危険性を示すものである。現在、生細胞を用いる選別法に用いる適切なベクターを開発中である。
現在得られているチロシルtRNA合成酵素改変体は、タンパク質には存在しないアジドチロシンを基質として認識できる。アジド基は反応性が高いので、アジドチロシン選択的に修飾を施すことができる。これを利用して、タンパク質の部位特異的に、蛍光修飾や、ビオチン修飾が行える手法を開発した(特許出願中)。また、非天然アミノ酸のバリエーションを広げることを念頭に、酵母フェニルアラニルtRNA合成酵素の改変も同時に進めている。現在、フェニルアラニンばかりではなくトリプトファンを基質とできる変異体が得られており、その解析を進めているところである。