原生生物光センサー物質の合成時における発現物質のクローニング

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14740464
• Research Institution: Hiroshima Prefectual College of Health Sciences
• Principal Investigator: 加藤 洋司 広島県立保健福祉大学, 保健福祉学部, 助手 (60326436)
• Keywords: Blepharisma / blepharismin / サブトラクション

Research Abstract

赤色色素を産生、蓄積する原生生物ブレファリズマとその培地素材を、高知大学理学部自然環境科学科松岡達臣教授から供与していただき、当研究機関で安定的に培養することに成功した。
暗所で培養したブレファリズマを集め、2℃の実験液(1mM CaCl_2, 1mM KCl, 5mM Tris-HCl, pH7.2)に数秒間懸濁することで低温刺激を与え、色素を失わせた後、再び暗所培養に戻し、色素を回復させた。
色素量回復途上のブレファリズマを回収し、total RNAを抽出し、mRNAを精製した。暗所培養した(低温刺激を施していない)ブレファリズマからもmRNAを調製した。これらのmRNA試料とし、Clontech社のPCR-select^<TM> cDNA Subtraction Kitを用いてcDNA化、サブトラクション反応および増幅を行った。このキットはPCR反応を応用し、2種類のmRNAグループから共通する配列を排除し、1グループに特異的あるいは優勢適に発現している配列のみを得ることを目的としたものである。
得られたcDNAをpGEMベクターに挿入後、大腸菌DH5αに形質転換し、有望な数十の単一コロニーからプラスミドを調製した。
現在、挿入部分の末端配列をシーケンシングし、得られた配列を相同検索により解析中である。
今後は、得られたクローンから、真に発現量に差のある配列を絞り込む予定である。