原生生物光センサー物質の合成時における発現物質のクローニング

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14740464
• Research Institution: Hiroshima Prefectual College of Health Sciences
• Principal Investigator: 加藤 洋司 広島県立保健福祉大学, 保健福祉学部, 助手 (60326436)
• Keywords: Blepharisma / ブレファリズマ / サブトラクション

Research Abstract

赤色色素を産生、蓄積する原生生物ブレファリズマとその培地素材を、高知大学理学部自然環境科学科松岡達臣教授から供与していただき、当研究機関で安定的に培養することに成功した。
暗所で培養したブレファリズマを集め、2℃の実験液(1mM CaCl_2,1mM KCl,5mM Tris-HCl,pH 7.2)に数秒間懸濁することで低温刺激を与え、色素を失わせた後、再び暗所培養に戻し、色素を回復させた。
色素量回復途上のブレファリズマを回収し、total RNAを抽出し、mRNAを精製した。暗所培養した(低温刺激を施していない)ブレファリズマからもmRNAを調製した。これらのmRNA試料を、Clontech社のPCR-Select^<TM> cDNA Subtraction Kitを用いてcDNA化、サブトラクション反応および増幅を行った。このキットはPCR反応を応用し、2種類のmRNAグループから共通する配列を排除し、1グループに特異的あるいは優勢的に発現している配列のみを得ることを目的としたものである。得られる配列は、キットの仕様上cDNAの制限酵素(Rsa I)断片である。
得られたcDNAをpGEMベクターに挿入後、大腸菌(DH5α)に形質転換し、有望な単一コロニーからプラスミドを調製した。
これらをオートシーケンサー(ABI 310 Applied Biosystems社)で解析した結果、200bp〜750bpの34種類のRsa I断片の配列を決定することに成功した。データベース検索の結果、細胞骨格であるチューブリン、植物のフルクトースビスリン酸アルドラーゼなどに相同性のあるものの他、機能不明なcDNA配列や相同性の低いものしか見つからないものもあった。
今回得られた配列を元に、プライマーを設計し、リアルタイムPCRによって、真に発現に差のあるものを絞り込み、その全長を決定する予定である。