酵母におけるD-アスパラギン酸に特異的な転写誘導機構の解明

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14760044
• Research Institution: Nagaoka University of Technology
• Principal Investigator: 高橋 祥司 長岡技術科学大学, 工学部, 助手 (90324011)
• Keywords: 酵母 / Cryptococcus humicola / ^D-アスパラギン酸酸化酵素 / 遺伝子 / 発現 / 組換え酵素 / 転写誘導 / 生理機能

Research Abstract

平成14年度の本研究においてC.humicola UJ1のD-アスパラギン酸酸化酵素(ChDDO)遺伝子の単離と大腸菌での活性発現に成功した。平成15度は、以下の事項について検討した。
1.ChDDO発現の基礎的解析と上流領域の単離
本酵素活性は、利用し易い窒素源であるアンモニアなどの共存下においてもD-アスパラギン酸(^D-Asp)の存在により誘導発現し、D-Aspを唯一の炭素源とした場合にも誘導が観察された。このことから、ChDDOの発現がカタボライト抑制の脱抑制によらないことが示唆された。また、ノーザン解析から、ChDDOはD-Asp特異的に転写段階で誘導されることが明らかとなった。ChDDO遺伝子上流領域約2kbpを単離し、既知の転写因子結合配列を検索したところ、ストレス応答配列など多数の転写因子結合配列の存在が確認された。現在、レポーター遺伝子を用いたシスエレメント解析系の構築が進行中である。
2.組換えChDDOの諸特性の解析
大腸菌で発現させた組換えChDDOを精製し、その酵素学的諸特性を解析したところ、組換えChDDOの基質特異性などの諸性質は酵母から精製したChDDOと一致した。現在、部位特異的変異導入によるChDDOの構造機能相関に関する研究が進行中である。
3.ChDDOの生理機能解析
ChDDO遺伝子破壊株を構築し、D-Aspを唯一の窒素源、炭素源および窒素源と炭素源とした培地における生育を観察したところ、野生株とは反対に、破壊株はいずれの培地においても全く生育しなかった。この結果より、ChDDOは本酵母においてD-Aspを代謝する唯一の酵素であり、D-Aspを栄養源として利用する役割を担っていることが明らかとなった。また、破壊株はD-Aspの毒性に対して高い感受性を示したことから、ChDDOが解毒酵素としても機能していることが明らかとなった。

Research Products

• [Publications] Takahashi, S., Takahashi, T., Kera, Y., Matsunaga, R., Shibuya, H., Yamada, R.: "Cloning and Expression in Escherichia coli of the D-Aspartate Oxidase Gene from the Yeast Cryptococcus humicola and Characterization of the Recombinant Enzyme"The Journal of Biochemistry. (発表予定).