2002 Fiscal Year Annual Research Report
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14770089
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| Research Institution | National Cancer Center Research Institute and Research Center for Innovative Oncology, National Cancer Center Hospital East |
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Principal Investigator |
藤井 元 国立がんセンター, 研究所・病理部, 研究員 (90321877)
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| Keywords | 核異型 / 遺伝子導入 / スクリーニング / GFP / IRES / 蛍光顕微鏡 / 核形態 / プラスミド調整 |
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| Research Abstract |
今年度で目標としていた実験系の確立は様々な改変を加えた結果、ほぼ完成した。
当初予定ではGFP融合蛋白質を利用して異型核内での局在性の変化を指標にスクリーニングを行う予定でいたが、この方法では予想以上に核内に移行する遺伝子産物が多く、陽性クローンの選択が困難であった。そこでより直接的に核異型を誘起できる能力を持った遺伝子を選択するために、以下のような実験系を考案した。すなわち真核細胞強制発現プロモーター下流に全長のcDNAライブラリーをdirectionalに組み込み、さらに蛋白質のバイシストロニックな共発現が可能になるIRES(Internal Ribosome Entry Site)部位を介して核全体に局在するよう核移行シグナルを融合させたGFP遺伝子をタンデムな形で繋げたプラスミドの遺伝子導入実験系である。これにより蛍光顕微鏡観察下では遺伝子導入された細胞でのみで核全体が緑色に確認されることになり、遺伝子導入による核形態変化を容易に観察可能な理想的な実験系が作成できた。この実験系では当初想定されたフレームの問題なども無いため、選択効率が3倍以上になることが予期され、この点でも大きな向上が期待される。さらに以前開発した多検体のプラスミド調整法にも様々な改良を新たに施すことで、遺伝子導入に必要なサンプル回収における質的・量的側面での進展をはかれた。
今年度予定では30000クローン程度をスクリーニングする予定であったが、計画の変更や手法の改善などに時間を振り向けた為、スクリーニング終了クローンは約5000クローンになってしまった。しかし安定した実験系が確立され、さらに陽性クローン選択にも自動化の可能性が見うけられることから計画終了時には想定していた50000クローンのスクリーニングは十分可能と考えている。
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[Publications] Y.Yamamoto, G.Eujii.et al.: "Overexpression of orphan G-protein-coupled receptor, Gpr49, in human hepatocellular carcinomas with β-catenin mutations"Hepatology. 37(3). 528-533 (2003)
