敗血症性ショックに関与するMIF遺伝子の発現調節機構の解明

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14770212
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 佐々木 貴史 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (70306843)
• Keywords: MIF / cDNAクローニング / タンパク質発現

Research Abstract

本年度は、MIFのcDNAをクローニングし、大腸菌発現ベクターに挿入してタンパク質を得る方法を確立するまでを目指した。
MIF遺伝子の非翻訳領域にプライマーを設計し、精巣から抽出したRNAを鋳型に作製した1st鎖のcDNAを鋳型として、RT-PCRを行った。得られたcDNAをプラスミドベクター(pBluescriptSK-II)を用いてクローン化した。このcDNAの塩基配列を決定して、報告されているMIF遺伝子と完全に一致することは確認した。
次に、MIFタンパク質をGlutathione S-transferase(GST)との融合タンパクの形で発現させるために、大腸菌の発現ベクターへの移し替えを行った。MIFcDNAのインサートを増幅するPCRプライマーを作製し、PCRを行った。予想された大きさのPCR産物を得ることができたので、これを制限酵素で処理し、電気泳動を用いて精製を行い、発現ベクターpGEX(Amersham)に組み込んだ。組み込まれたインサートは塩基配列を決定して、MIFのcDNAであることは確認した。さらに、この発現ベクターを用いてMIFタンパク質の発現を行った。タンパク質の発現は、発現ベクターを用いて大腸菌を形質転換し培養後IPTGを加え発現誘導を行った。誘導後、大腸菌の集菌を行い大腸菌を破砕しSDS-PAGE電気泳動を行った。その結果、GSTタンパク質と融合したMIFが予想された大きさに発現されていることが確認できた。SDS-PAGE電気泳動後にウェスタンブロッテイングを行い抗GST抗体で検出を行った結果、陽性のバンドが確認された。