2003 Fiscal Year Annual Research Report
膵島におけるグルタミン酸によるインスリン分泌制御機構の解析
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14770600
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
山田 浩司 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助手 (80325092)
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| Keywords | insulin / glutamate |
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| Research Abstract |
β細胞のAMPA型受容体がエンドサイトーシスされるかを検討した。AMPA受容体の細胞外部分を特異的に認識する抗体を用いMIN6 m9細胞をラベルした後グルタミン酸もしくはAMPAで刺激する。その後、酸性緩衝液にて細胞外の抗体を除き、細胞内に取り込まれた抗体を免疫染色法により検出した。実際にそれらの刺激によりエンドサイトーシスが起こった。さらに、先に細胞外膜蛋白質をNHS-SS-biotinを用いてラベルした後グルタミン酸もしくはAMPAで刺激する。その後、細胞外の活性化biotinをグルタチオンにより不活性化した後エンドサイトーシスされたbiotin化AMPA受容体をビオチン・アビジンの結合を利用してアビジンビーズで沈降する。ビーズと共に沈降したAMPA型受容体をウエスタンブロッティング法を用いて検出した。この方法においてもAMPA型受容体のエンドサイトーシスが検出できた。さらに、AMPA刺激によるGluR2/3のエンドサイトーシスは、その競合的アンタゴニストによって、ほぼ完全に阻害された。また、上記の方法によりAMPA刺激によるエンドサイトーシスは、電位依存性である証拠がえられた。β細胞には機能的にAMPA型受容体が発現しており、その受容体はリガンド依存性にエンドサイトーシスされることを実証することができた。
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