高度好熱菌SecYEタンパク質膜透過チャネルの構造生物学的解析

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14780542
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 森 博幸 京都大学, ウイルス研究所, 助手 (10243271)
• Keywords: タンパク質膜透過 / SecY / SecE / SecA / X線結晶解析 / 蛍光共鳴エネルギー転移(FRET) / クライオ電子顕微鏡

Research Abstract

(目的)タンパク質膜透過反応は、膜透過「チャンネル」を介して起こる。膜透過チャンネルは、膜の透過障壁としての機能を保ちつつ、巨大なタンパク質分子を膜透過させる極めて厳密なゲート制御の機構を保持しているが、その実体は不明である。膜透過反応を分子レベルで理解する為には、膜透過チャンネルの構造生物学的解析は欠かせない。主要な構成因子であるSecYは10回の膜貫通領域を持つ疎水的なタンパク質であり、大量発現、精製等には多くの困難を伴う。本研究では、タンパク質の精製・結晶化に有利であると考えられる高度好熱菌Thermus thermophilus HB8を材料として、SecYE膜透過装置の構造生物学的解析を目的としている。
(成果)高度好熱菌T. thermophilus HB8由来のSecYE複合体(TSecYE)の過剰発現用プラスミドを構築した。この発現系により、細胞質膜タンパク質の約10%程度にまでT.SecYEを蓄積させることにも成功した。過剰発現膜を界面活性剤で可溶化後、3段階のクロマトグラフィーにより、純度95%以上のT.SecYE複合体をmg単位で精製できる系を確立した。平行して、膜透過駆動モーターTSecA ATPaseの発現精製系も同時に構築した。精製T.SecYEを組み込んだ再構成プロテオリポソームを用いたin vitro膜透過実験より、精製TSecYE複合体は、TSecA, ATPに依存したタンパク質膜透過活性を保持していることを明らかにした。この実験系を用いて、TSecYE複合体が、膜内で安定なオリゴマー構造を持つことをFRET(蛍光共鳴エネルギー転移)解析より示した。更に、精製TSecA, TSecYE複合体の結晶化を試みており、予備的ではあるが、既に結晶を得ている。今後の構造解析に期待が持てる。

Research Products

• [Publications] Kazuhiro Chiba, Hiroyuki Mori, Koreaki Ito: "Roles of the C-terminal End of SecY in Protein Translocation and Viability of Escherichia coli"Journal of Bacteriology. 184(8). 2243-2250 (2002)
• [Publications] Hiroyuki Mori, Koreaki Ito: "Biochemical Characterization of a Mutationally Altered Protein Translocase : Proton Motive Force Stimulation of the Initiation Phase of Translocation"Journal of Bacteriology. 185(2). 405-412 (2003)
• [Publications] Hiroyuki Mori, Yoshinori Akiyama, Koreaki Ito: "A SecE Mutation That Modulates SecY-SecE Translocase Assembly, Identified as a Specific Suppressor of SecY Defects"Journal of Bacteriology. 185(3). 948-956 (2003)
• [Publications] Hiroyuki Mori, Yuhsuke Shimizu, Koreaki Ito: "Superactive SecY Variants That Fulfill the Essential Translocation Function with a Redused Cellular Quantity"The Journal of Biological Chemistry. 277(50). 48550-48557 (2002)
• [Publications] Hiroyuki Mori, Tomoya Tsukazaki, et al.(計9名): "Fluorescence Resonance Energy Transfer Analysis of Protein Translocase : SecYE from Thermus thermophilus HB8 Forms a Constitutive Oligomer in Membranes"The Journal of Biological Chemistry. 278(in press). (2003)
• [Publications] Naomi Shimokawa, Hiroyuki Mori, Koreaki ito: "Importance of transmembrane segments in Escherichia coli SecY"Molecular Genetics and Genomics. (in press). (2003)