アプタマーテクノロジーを利用した新規高感度植物ウイルス・ウイロイド診断法の開発

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14F04078
• Research Institution: Hirosaki University
• Principal Investigator: 佐野 輝男 弘前大学, 農学生命科学部, 教授 (30142699)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): KAPONI Maria 弘前大学, 農学生命科学部, 外国人特別研究員
• Project Period (FY): 2014-04-25 – 2017-03-31
• Keywords: 核酸アプタマー / セレックス / ウイロイド / 高感度診断技術

Outline of Annual Research Achievements

標的ウイロイド配列の選抜とランダムオリゴヌクレオチドライブラリーの構築
① 標的分子の選抜（プライマー設計）：30－100塩基長の標的分子を作成：　初年度はまずアプタマー選抜の基となる標的ウイロイド配列をデザインした。危険度の高いジャガイモやせいもウイロイドの種内保存配列、及びポスピウイロイド属共通配列などをバイオインフォマティクスツールを用いて分析、抽出し、ポスピウイロイド属の中央保存領域、左末端領域、及び病原性領域に由来する標的分子を作成する実験系を構築した。
② ランダムな塩基配列を有するオリゴヌクレオチドライブラリー創出：ランダムな配列を有するオリゴヌクレオチド（30－70塩基）を人工合成し、T7RNAポリメラーゼプロモーター配列の下流に連結し、T7RNAポリメラーゼでランダムオリゴヌクレオチドライブラリー（約1015分子種）を転写した。
現在①と②を用いてSELEX（セレックス）法による選抜を実施中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の計画通り、ウイロイドを標的とした特異性の高い核酸アプタマーを選抜する研究を開始し、まず、標的となるウイロイドＲＮＡの保存配列と種特異的配列を設計し、人工合成したＤＮＡから試験管内で標的ＲＮＡを転写し、純度の高い標的ＲＮＡを調製する実験系を確立できた。また、アプタマー選抜の元になる３０－４０塩基の合成ＤＮＡライブラリーを設計し、それからＤＮＡ或いはＲＮＡを調製する実験系を構築することが出来た。現在、ライブラリーと標的分子を用いて、セレックス法による選抜を始めている。すなわち、当初の計画で予定した目標を達成できたため。

Strategy for Future Research Activity

セレックス法を用いた核酸アプタマーの選抜のための実験系を構築できたので、今後、セレックス法による選抜実験を出来る限り多く繰り返し、標的とするウイロイドと特異的に結合できるＤＮＡ及びＲＮＡアプタマーを選抜する予定である。選抜実験の成否は偶然による要素も多少含まれているので、成功の確率を上げるためには、出来るだけ実験回数を多くこなすことが求められる。選抜の際の反応温度条件、アプタマー濃度など、条件を変えながら選抜を繰り返すことで、効率よく選抜するための基礎データを蓄積したい。