2015 Fiscal Year Annual Research Report
アプタマーテクノロジーを利用した新規高感度植物ウイルス・ウイロイド診断法の開発
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14F04078
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| Research Institution | Hirosaki University |
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Principal Investigator |
佐野 輝男 弘前大学, 農学生命科学部, 教授 (30142699)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
KAPONI MARIA 弘前大学, 農学生命科学部, 外国人特別研究員
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| Project Period (FY) |
2014-04-25 – 2017-03-31
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| Keywords | DNAアプタマー / ウイロイド / セレックス / ビオチンラベルプライマー / 磁気ビーズ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
セレックス法によるウイロイド診断用アプタマーの選抜；平成26年に構築したランダムオリゴヌクレオチドライブラリからセレックス法により、標的ウイロイド配列と結合するDNAアプタマー選抜のための実験系を構築した。①様々なウイロイド種から最も実害の大きいジャガイモやせいもウイロイド（PSTVd）を選択し、その全長配列と病原性領域を試験管内で転写するシステムを構築した。②40塩基のランダム配列の両側に20塩基ずつのPCR増幅用配列を設計した。この際に、各配列は標的とするPSTVd配列と相同性を持たないように、また、特異な高次構造をとらないように工夫した。③PSTVdの全長分子（180番～179番）或いは病原性領域に由来するRNAをビオチン化し、ストレプトアビジンでコートした磁気ビーズに結合させた。④上記③にランダムオリゴヌクレオチドを混合し、室温から60℃の条件でインキュベートし、即座に洗浄し、磁気ビーズに結合しているPSTVd分子と結合したオリゴヌクレオチドを回収した。⑤回収したオリゴヌクレオチド分子を上記②のプライマーを用いてPCRで増幅した。この際に、プラス鎖とマイナス鎖を分離（ストランドセパレーション）するために、一方のプライマーにはビオチン或いはジゴキシゲニンを結合させ検討した結果、ビオチンラベルがより効率よくストランドセパレーションの効果を評価できた。⑥この実験系を用いてセレックス法の予備試験を行い、現時点までに、PSTVd分子と結合する能力を有するオリゴヌクレオチドを効率よく分離、増幅できる実験系であることが確認できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画に従って実験を進め、ランダムな配列を有するオリゴヌクレオチドライブラリーから標的であるウイロイドの主要種であるジャガイモやせいもウイロイド（PSTVd）に結合する能力を有するDNAアプタマーを選抜する実験系の構築にほぼ成功した。セレックス法でランダムなオリゴヌクレオチドから標的分子と結合するものを選抜・濃縮する際に最も重要となるアプタマー候補分子の「回収－再増幅技術」に関して、①片方のDNA鎖をビオチン化すること、②わずか数塩基のサイズの違いで識別・分離することなどの工夫を凝らして克服することができた。
以上、今後のセレックス実験のプロトコールがほぼ感染した点で計画通りに進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成27年度までの研究によって、ウイロイドRNAに結合するDNAアプタマーを選抜するためのセレックス法の実験プロトコールが一定の完成をみた。そこでこれからは、この実験系に基づいて、PSTVdの全長RNA或いは病原性領域に由来するRNAを標的にしてランダムDNAライブラリーからセレックス法によりPSTVd結合能を有するオリゴDNAアプタマーを選抜する実験を本格化させる。
セレックス法は「ランダムDNAライブラリーと標的分子の結合―洗浄（非特異的に結合していDるDNAの除去）―再増幅による濃縮」の一連の過程を2～20サイクル繰り返し、数サイクル毎に増幅されたオリゴDNA集団の塩基配列を分析し、どのような配列がどの程度濃縮されてくるかを吟味して、よりPSTVd結合能の高いオリゴDNA分子を選抜する。最終的に得られた分子のPSTVd結合力の強さをランダムなオリゴDNAと競合検定により分析し、PSTVd検出用アプタマー候補分子の特性を論文等にまとめて公表する。
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