2016 Fiscal Year Annual Research Report
アプタマーテクノロジーを利用した新規高感度植物ウイルス・ウイロイド診断法の開発
| Project/Area Number |
14F04078
|
|---|
| Research Institution | Hirosaki University |
|---|
Principal Investigator |
佐野 輝男 弘前大学, 農学生命科学部, 教授 (30142699)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
KAPONI MARIA 弘前大学, 農学生命科学部, 外国人特別研究員
|
|---|
| Project Period (FY) |
2014-04-25 – 2017-03-31
|
| Keywords | ウイロイド / アプタマー / セレックス / 次世代シークエンス解析 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
アプタマー選抜の中核技術となるSELEX法には様々な因子が関与するため、ランダムオリゴ配列の長さ、濃度、温度、分離方法などを最適化する必要がある。特異な高次構造を有する自己複製型RNA病原体であるウイロイドを標的とするアプタマーを選抜するためのSELEX法プロトコールの確立を目指し、以下の諸条件を最適化し、アプタマー候補配列の濃縮に成功した。
まずビオチン化標的PSTVd分子に結合したssDNAはストレプトアビジンコート磁気ビーズで回収する。市販の数種類の磁気ビーズを試し、ダイナビーズM-270（インビトロジェン社）とダイナビーズC1（インビトロジェン社）を選定し、ダイナビーズT1/M280とマグネスフェアーSA-PMPs（プロメガ社）が相補鎖分離に効果的である結果を得た。
次に、SELEX法の結合、洗浄、溶出緩衝液のモル濃度、処理条件、競合実験条件等を検討し、最終的に6.32ピコモルの弱結合コントロールと20塩基、30塩基、40塩基のランダムDNAライブラリーから15ラウンドのSELEX選抜で濃縮したssDNA集団と10倍段階希釈した陽性対照混合液を、62ピコモルの標的PSTVd分子が結合している磁気ビーズに加える実験条件を確立した。因みにこの時の標的分子と結合分子（アプタマー候補分子）の比率は約10：1になる。また、1、5、10ラウンド目のssDNA試料の一部をPCR－クローニング後、塩基配列を分析し、さらに、10ラウンド目の試料を次世代シークエンス・アンプリコン解析にかけ、集団内の多様性を分析し、アプタマー候補となりうる配列を濃縮することに成功した。
|
| Research Progress Status |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
|
| Strategy for Future Research Activity |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
|
