腫瘍透過ペプチド修飾ホウ素リポソームを用いたがん細胞選択的新規中性子捕捉剤の開発

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14J00574
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 渡邉 翼 京都大学, 医学研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2014-04-25 – 2017-03-31
• Keywords: ホウ素中性子捕捉療法 / リポソーム

Outline of Annual Research Achievements

リポソームに内包させるホウ素製剤としてヒトに対しても使用実績のある1分子あたり12個のホウ素原子を持つBSHを使用したが、BSHと使用を予定していたペプチド配列が相互作用を起こし凝集してリポソーム化後にうまく分散しないことが分かった。凝集の原因の一つとしてBSHの電荷が考えられたため、相互作用を低減させるためにアニオンであるBSHに対してカウンターカチオンとしてポリアミンを用いてBSHの電荷の影響を減らし、BSHとポリアミンを結合させた状態でリポソームに内包させることでペプチドとの相互作用を減弱させた。リポソーム表面のペプチドの修飾は、ペプチドC末にシステインをつけ、システインと脂質化ポリエチレングリコール-マレイミドとを化学的に結合させてペプチド誘導体としたものを用いて、post insertion法、逆相蒸発法によりそれぞれ行った。
作成したリポソーム濃度を振って腫瘍細胞に投与し、表面をペプチドにて修飾していないホウ素内包リポソームに比べて、ペプチド修飾を行ったホウ素内包リポソームがどれくらい取り込み効率が増強されるかを調べたところ、ペプチド修飾を施したリポソームは最大1.7倍の取り込み増強効果を認めた。
ペプチド配列の腫瘍特異性を確かめるため、ペプチド配列のC末にシステインをつけ、マレイミドを介してFITCを結合させ、FITC化ペプチドを様々な腫瘍細胞および線維芽細胞に投与しペプチド取り込みの腫瘍選択制を評価した。その結果、腫瘍細胞への取り込みだけでなく線維芽細胞にも腫瘍細胞とほぼ同等の取り込みを認め、ペプチドの修飾の方法などによっては腫瘍特異性に問題が生じる可能性が示唆された。
今後用いるペプチド配列・立体構造を変化させることにより腫瘍特異性を損なわずにペプチド修飾リポソームによる取り込みをさらに増強させることができるよう検討していく。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

リポソーム作成に関して内包するホウ素製剤とペプチドの相互作用により凝集するなどの想定していない課題が明らかとなりカウンターカチオンの検討、表面修飾方法の検討などを順次行うことにより凝集を回避して作成する方法を確立したが解決に至るまでに時間がかかったこと、および既存の報告の腫瘍特異性はペプチドの修飾方法により変化してしまう可能性があることがわかりペプチド配列そのものの検討を要することから予定していた達成度には到達しなかった。腫瘍特異性に問題が生じた可能性として、ペプチドC末修飾をしたことによる立体構造の変化や、リポソーム表面にペプチドの片方の端を固定化したことによるフォールディングなどへの影響が考えられる。今後の研究の推進方策として、ペプチドの修飾方法およびペプチドの腫瘍特異性・細胞透過性の鍵となる配列部分、ペプチドの標的タンパク質などを具体的に明らかにし、ホウ素原子の腫瘍細胞への取り込み増強と腫瘍特異的集積につなげていけるよう検討を行う。

Strategy for Future Research Activity

現在までの進捗でペプチドの腫瘍特異性に問題があるということと現在の修飾方法ではリポソーム表面をペプチドC末を固定化させて修飾しても取り込み効率が非修飾リポソームに比べてそれほど増強しないという課題が明らかとなった。今後、ペプチド配列の既に報告されているような腫瘍特異性・細胞透過性を決定づけるキーとなる立体構造の解明とペプチド配列の標的タンパク質の同定がまず必要である。また、リポソームの表面をペプチドにより修飾を施したが、細胞透過性の機序としてリポソームをエンドサイトーシスにより取り込ませることに大きさの点などから無理がある可能性があり、他のナノデバイスを用いた検討も考慮する。