2014 Fiscal Year Annual Research Report
オルガネラゲノム核様体の構造様式：その蛋白質構成、ダイナミズムに迫る
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14J00786
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
小林 優介 京都大学, 理学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2014-04-25 – 2017-03-31
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| Keywords | 葉緑体核様体 / 細胞内共生 / 進化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
葉緑体核様体はすべての植物細胞で観察される構造である。先行研究によって、藻類ではバクテリア型ヒストン様タンパク質HUが主成分であることが報告されていた（Kobayashi et al. 2002）。一方、陸上植物ではHU遺伝子が消失し、代わりに細胞核において染色体の構造維持に関わるドメインタンパク質が核様体構造の維持に関わることが知られていた (Melonek et al. 2012)。では、葉緑体祖先のシアノバクテリア核様体は細胞内共生後にどのような変化を経て陸上植物の葉緑体核様体へと進化したのだろうか。この謎に挑むべく申請者は、緑色植物の進化の変遷過程を表すと考えられている、緑藻クラミドモナス、車軸藻綱クレブソルミディウム、基部陸上植物ゼニゴケを解析した。
本年度は、まず質量分析法をもちいた藻類クラミドモナスの葉緑体核様体のコア因子の探索に取り組んだ。その結果、これまでその存在が示されてきた細菌型ヒストン様タンパク質HU に加え、SAPドメインをもつ真核生物型の新規因子(CreSAP)などを同定することに成功し、藻類クラミドモナスの葉緑体核様体が細菌型と真核生物型のタンパク質群からなるハイブリッド構造をもつことを証明した。車軸藻綱クレブソルミディウムには、HUを含む既知の葉緑体核様体構成因子がすべてコードされていた。これらのタンパク質は間接蛍光抗体法によって、葉緑体核様体に局在することが確認できた。しかし、基部陸上植物においては、HU遺伝子をゲノム中から同定することができず、陸上植物の進化の初期段階でHU遺伝子が消失したと考えられる。
以上の結果から、シアノバクテリアの核様体構成因子は緑色植物の進化の初期段階から宿主由来の核様体タンパク質に置き換わりはじめていたことが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
葉緑体DNAがシアノバクテリア由来であることは、様々な研究から疑いようのない事実であると考えられているのに対し、葉緑体核様体の構成タンパク質は植物種間で多様性に富むため、これまで葉緑体核様体構造の進化についての包括的な理解が遅れていた。当初、申請者は単細胞性緑藻クラミドモナスと高等植物を比較することで、葉緑体核様体構造の進化に迫ろうと計画していた。しかし、車軸藻綱クレブソルミディウムの核ゲノムが公開されたことで（Hori et al. 2014)、緑藻よりも進化的に陸上植物に近い藻類の解析が可能となった。また、強固な細胞壁をもつため困難であったクレブソルミディウムの間接蛍光抗体染色を、凍結融解法を用いることで世界で初めて成功させた。さらに、共同研究により最基部陸上植物ゼニゴケの解析を行うことで、陸上植物の進化についても議論できるようになった。そのため、当初の計画よりも緑色植物における葉緑体核様体の進化をより深く俯瞰することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞周期や分化によって、葉緑体核様体の形態は大きく変化することが知られている。しかし、その形態制御の分子メカニズムはあまり明らかとなっていない。そこで申請者は、葉緑体核様体分散に異常のある単細胞性緑藻クラミドモナスの変異体の解析を行うことでこの葉緑体核様体形態制御の謎に迫ろうと考えている。
現在までに、複数の変異体の原因遺伝子領域を古典的なマッピングとTAIL-PCRによって決定し、そのうちの１つは遺伝子導入による相補検定によって原因遺伝子を同定することに成功した。
今後は、さらに他の変異体の原因遺伝子を相補実験によって同定する。その後、細胞周期におけるそれらの原因遺伝子産物の消長および修飾の変化を解析するとともに、in vitroでのDNA結合能などを評価する。また、共免疫沈降と質量分析を用いることで、相互作用するタンパク質を網羅的に探索する。これらの相互作用するタンパク質は、発現抑制や過剰発現行い葉緑体核様体の形態変化を観察することで、逆遺伝学的に機能を解析する。
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