2015 Fiscal Year Annual Research Report
ＥＢウイルスがコードするＤＮＡポリメラーゼの機能ドメインの詳細な解析
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14J01982
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
成田 洋平 名古屋大学, 医学系研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2014-04-25 – 2017-03-31
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| Keywords | EBウイルス / ヘルペスウイルス / ウイルスゲノム複製 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではヘルペスウイルスのDNAポリメラーゼのみに保存されているアミノ酸モチーフに着目しており、Burkitt lymphomaなどを引き起こす原因ウイルスであるEpstein-Barr virus(EBV)がコードするDNAポリメラーゼのN末端領域に保存されているアミノ酸モチーフの意義を明らかにすることを目的としている。
H27年度は注目している2種のアミノ酸モチーフの片方（アミノ酸モチーフ①とする）について、H26年度に得られた結果をより強固なものとするためにDNAポリメラーゼのアミノ酸モチーフに変異を入れた組換えEBVを作製し、さらにその感染細胞（HEK293-EBV-BAC）を樹立した。予想通り、モチーフに変異が入ったウイルスをもつ細胞ではウイルスゲノム複製の効率が著しく低下することが分かった。これらの結果はScientific Reports誌に掲載された(Narita Y. et al. Sci. Rep. 5, 11767)。
また、注目しているもう一方のアミノ酸モチーフ②についての研究も行った。その重要性を調べる為にモチーフを含んだ領域とその周辺を10アミノ酸ずつ順番に欠落させたEBVのDNAポリメラーゼ発現プラスミドを計10種類作製した。それらをそれぞれ「EBV DNAポリメラーゼを欠損させたウイルス感染細胞」にtransに発現させ、感染細胞内でのウイルスDNA複製効率について検討した結果、モチーフの有無に関わらず、アミノ酸モチーフ②の領域周辺の変異はDNA複製そのものを阻害するという結果が得られた。その原因として、変異を入れた部分はポリメラーゼ活性と関わりの無い部分であることから、この領域はDNAポリメラーゼの構造維持に必須なのではないかと考えた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
アミノ酸モチーフ①の欠損がウイルスゲノム複製に重要であることを細胞・ウイルスレベルで証明することが出来たので、当初の計画通りに研究課題は進捗している。しかし、現象のメカのズムの解明に迫るまでは進んでおらず、次年度に是非とも達成したいと考えている。また、アミノ酸モチーフ②の重要性に関する研究は実験当初に予期していなかった結果を得て研究が頓挫している為。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在、下記に述べるようにアミノ酸モチーフ①についての研究で得られる結果の重要性が高いという理由から、アミノ酸モチーフ②に関する研究は中断している。
今後は、アミノ酸モチーフ①がヘルペスウイルスのゲノム複製開始に重要な役割を担っているという仮定の下、メカニズムを明らかにするためにモチーフと相互作用するタンパク質の同定に取り組む予定である。H28年度にはGST pulldown法もしくは免疫沈降法の2種の方法にて得られた沈降物を質量分析装置で網羅的に解析することでアミノ酸モチーフ①と機能的に相互作用する目的タンパク質の同定を行い、ヘルペスウイルスに特異的な新規ゲノム複製機構のモデルを提唱したい。
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