エクソソームのがん細胞指向性解析に基づく高選択的薬物送達法の開発

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14J02568
• Research Institution: Kyoto Pharmaceutical University
• Principal Investigator: 戸田 侑紀 京都薬科大学, 薬学研究科, 特別研究員(DC2)
• Project Period (FY): 2014-04-25 – 2016-03-31
• Keywords: エクソソーム / DDS / 脂質

Outline of Annual Research Achievements

申請者は、神経膠芽腫由来エクソソーム(U251exo)が正常細胞であるヒトアストロサイ(Ast)に比べて、由来がん細胞に効率よく導入されることをこれまでに示した。がん細胞由来エクソソーム については、受容細胞へ膜融合する際の分子メカニズムの詳細は不明であり、エクソソームの DDS 医薬品応用に向けて、その細胞指向性および膜融合に寄与する因子を分子レベルで解明する必要がある。そこでまず、本現象がU251exo自身の性質によるものかどうか検証したところ、Ast由来エクソソーム(Astexo)の取り込みはがん／正常細胞共に僅かであった。つまり、U251exoのがん細胞指向性はがん細胞の非特異的な取り込みではなく、本エクソソームの特徴的な構成因子の認識によるものと考えられた。次にU251exoの指向性を生み出す因子を同定するため、酵素処理によりエクソソームの表面タンパク質リガンドを脱落させ取り込みの変化を評価したが、がん細胞への高い集積が依然観察され、表面タンパク質リガンドは本現象への寄与が低いことが示唆された。一方で、がん／正常細胞由来の細胞外ベシクルの脂質組成が各々異なることをこれまでの薄層クロマトグラフィーを用いた実験で示した。本結果の精査のため脂質分析の条件を種々検討し再試したところ、がん細胞由来の細胞外ベシクルでphosphatidylethanolamineの組成比が高く、sphingomyelinの割合が低いことがわかった。本成果は、U251exoの特徴的な脂質組成を利用し、簡便に調製可能ながん選択的ドラッグデリバリーシステムを開発する上で極めて重要な知見である。本成果の一部は、Biochemical and Biophysical Research Communications紙に受理掲載された。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

申請者が着目している“がん細胞由来エクソソームが由来がん細胞へ効率よく導入される”現象における、導入機序についてはこれまでほとんど検討がなされていないため、本指向性に関与する生体成分(タンパク質・糖質・脂質)を分子レベルで同定するには、系統的解析が必要であった。解析の結果、主要生体分子のうち少なくとも表面タンパク質リガンドの寄与は低く、特徴的な脂質を有したエクソソームであることまでを明らかにした。以上の系統的検討結果は、Biochemical and Biophysical Research Communications誌に速報として掲載されており、当初計画をしのぐペースで解析研究が進展している。

Strategy for Future Research Activity

エクソソーム表面の糖鎖に注目し、endoglycosidase処置などによりU251exoの糖タンパク質や糖脂質とがん細胞指向性との関連性について検証する。またU251exoのがん細胞指向性を規定する因子がその特徴的な脂質組成であるかを調べるために、本エクソソームの全脂質を抽出しそれらで再構成したリポソームを作製し、がん細胞への取り込みを評価する。作製したリポソームががん細胞選択的に取り込まれることが確認され次第、siRNAなどの各種薬剤を導入し、抗がん活性やがん細胞内への選択的な薬物送達能を株化細胞およびモデル動物を用いて評価し、作製したリポソームの薬物キャリアとしての有用性を確認する。リポソームのがん細胞選択性が乏しい場合、U251exoの表面膜電荷、膜流動性をゼータ電位、Laurdan 試薬処置により求め、膜物性を評価し、得られた情報をリポソーム作製に反映する。

Research Products

• [Journal Article] Effective internalization of U251-MG-secreted exosomes into cancer cells and characterization of their lipid components (2015)
  • Author(s): Toda, Y., Takata, K., Nakagawa, Y., Kawakami, H., Fujioka, S., Kobayashi, K., Hattori Y., Kitamura, Y., Akaji, K., Ashihara, E.
  • Journal Title: Biochemical and Biophysical Research Communications Volume: 456 Pages: 768-773
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2014.12.015
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] 由来がん細胞へホーミングするglioblastoma由来エクソソームの解析-がん標的化技術応用のための指向性決定因子の探索- (2014)
  • Author(s): 戸田 侑紀、高田 和幸、中川 由布子、川上 光、藤岡 周助、小林 数也、服部 恭尚、北村 佳久、赤路 健一、芦原 英司
  • Organizer: 第64回日本薬学会近畿支部総会・大会
  • Place of Presentation: 京都
  • Year and Date: 2014-10-11 – 2014-10-11
• [Presentation] The unique lipid components of glioblastoma-derived exosomes for their effective incorporation into cancer cells (2014)
  • Author(s): Yuki Toda, Kazuyuki Takata, Kazuya Kobayashi, Yasunao Hattori, Kenichi Akaji, and Eishi Ashihara
  • Organizer: The 73rd Annual Meeting of the Japanese Cancer Association
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 2014-09-25 – 2014-09-27
• [Presentation] Cancer cell tropism of glioblastoma-derived exosomes regulated by their lipid components (2014)
  • Author(s): Yuki Toda, Kazuyuki Takata, Yuko Nakagawa, Hikaru Kawakami, Shusuke Fujioka, Kazuya Kobayashi, Yasunao Hattori, Yoshihisa Kitamura, Kenichi Akaji, and Eishi Ashihara
  • Organizer: FEBS EMBO 2014
  • Place of Presentation: パリ
  • Year and Date: 2014-08-30 – 2014-09-04
• [Presentation] がん細胞選択的ドラッグデリバリー応用を目的としたエクソソームの脂質組成解析 (2014)
  • Author(s): 戸田侑紀、高田和幸、中川由布子、川上光、藤岡周助、小林数也、服部恭尚、北村佳久、赤路健一、芦原英司
  • Organizer: 第6回日本RNAi研究会
  • Place of Presentation: 広島
  • Year and Date: 2014-08-28 – 2014-08-30