2014 Fiscal Year Annual Research Report
蛍光相関分光法による転写因子ＦＭＢＰ－１高速ＤＮＡ認識動態の多成分同時定量解析
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14J02640
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
堤 元佐 北海道大学, 生命科学院, 特別研究員(DC2)
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| Project Period (FY) |
2014-04-25 – 2016-03-31
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| Keywords | 国際情報交換 / 転写調節機構 / 生物物理学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
「生細胞内で発現された転写因子の段階的なDNA認識動態について、各段階の動態の拡散特性を定量化し、それらの拡散動態が生じるために必要な外的・内的環境条件を決定づけること」を目的とし、北海道大学 細胞機能科学研究室のご協力の下、以下の実験を行った。
（１）カイコ絹糸腺組織でのin situ-FCS解析の完了： カイコ由来転写因子FMBP-1のin situにおける動態解析のため、カイコ5齢幼虫の後部絹糸腺内において、パーティグルガン法でEGFP-FMBP-1蛋白質の一過的導入・発現を行い、蛍光相関分光法（FCS）を用いて解析した。その結果、野生型のEGFP-FMBP-1は申請書に記載したHeLa細胞における解析結果と同様、4つの拡散動態を示すことが明らかになった。さらに比較のため、DNA結合能を欠損させた変異体を導入・発現させた細胞においても解析を行った結果、こちらもHeLa細胞での観察と同様の結果を示した。これらの結果から、in situ環境においてもFMBP-1が段階的DNA動態を示すことが明らかになった。
（２）細胞ライセートFCCS解析： 生細胞内FCS解析によって明らかとなったEGFP-FMBP-1の細胞核内動態の特性をより詳細に検討するために、EGFP-FMBP-1発現細胞を界面活性剤Triton X-100で溶解処理し、認識配列・ランダム配列DNAプローブを添加した状態で蛍光相互相関分光法（FCCS）による測定を行った。その結果、相互作用の強度を示すRelative Cross Amplitude (RCA)値は、認識配列DNAプローブに対してのみコントロール(EGFP単独発現細胞のライセート中で測定)よりも有意に高い値を示した。今後はDNA分子濃度によるDNA相互作用の変化を定量化するため、Kdの算出を試み、さらに核内動態再現のための条件検討を進める予定である。
（３）論文投稿： HeLa細胞、カイコ後部絹糸腺細胞におけるFCS解析について論文を執筆し、海外学術誌に投稿した。2015年4月現在、レビュワーによる審査中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度に計画していた、ライセートFCCS実験系の確立は計画どおり達成できた。また、予定していた論文投稿にも踏み切り、現在審査中ではあるが計画当初の予定通りに進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在のところ、大きな問題点は生じていない。そのため、当初の計画に沿って研究を遂行する予定である。前年度に得られた研究結果については、次年度の早い時期に論文投稿すべく、現在執筆中である。また、次年度にはスウェーデン・カロリンスカ研究所において、先端的な蛍光顕微鏡技術を用いてより詳細な解析を行う計画である。
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