2014 Fiscal Year Annual Research Report
神経上皮における細胞運命決定の研究：新規三次元可視化手法による「微小環境」解析
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14J04218
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
川上 巧 名古屋大学, 医学系研究科, 特別研究員(DC2)
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| Project Period (FY) |
2014-04-25 – 2016-03-31
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| Keywords | 細胞運命 / 細胞間相互作用 / 細胞間接触 / ライブ観察 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請書（「研究目的・内容」欄）に記述した研究目的の通り、[目的１]任意の娘細胞と分化途上細胞との細胞間接触を可視化・定量化するために、①分化途上細胞の可視化システム構築と、②細胞間接触の可視化システム構築およびその定量化を行った。①では、「脳原基中で分化途上細胞の可視化」を狙って作成していたNeurog2-d4VenusマウスおよびGadd45g-d4Venusマウスが本目的に適うか、免疫組織化学、ライブ観察等の手法を用いて解析し、期待通りのツールが作製できたことを見いだした（この成果は26年度に国際誌にて報告した）。②では、細胞間接触をライブ観察するために、3D組織培養下で全細胞の輪郭を可視化する方法を確立した。これには細胞膜を蛍光標識するFM4-64を用いた。前述したGadd45g-d4Venusマウスの大脳原基をFM4-64で染色することで、任意の娘細胞が分化途上細胞（Venus陽性）および未分化細胞（Venus陰性）と接触する様子をライブ観察することが可能となった。さらに取得した観察画像を3D再構成することで、娘細胞と接触する細胞数、接触面積、接触時間を定量的に示すことに成功した。
[目的２]分化途上細胞（Delta提示細胞）は自身のどこにDeltaタンパクを提示しているのか明らかにする為に、③Deltaタンパクに対する免疫染色をおよび④Delta-Venus knockinマウス（Deltaが局在する場所にVenusシグナルが検出される：未発表）を用いた免疫電顕を行った。③では、大脳原基においてDeltaタンパクは分化途上細胞のアピカル突起全体に検出された。④では、アピカル突起先端付近の細胞膜表面にVenusタンパク（Delta-Venus）の局在が観察された。現在、免疫電顕による解析範囲をアピカル突起先端付近だけでなく細胞全身にまで拡大している。この解析により細胞膜に存在するDeltaの分布が明らかになると、（細胞間接触で）細胞運命に影響を与え得る部位が、細胞のどの辺りに存在するのか見いだせる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究計画に沿って、①任意の細胞と分化途上細胞との細胞間接触を高分解能でライブ観察するシステムを構築し、細胞間接触の定量化（接触時間・面積の算出）が可能であること見いだした。なお、「分化途上細胞の可視化」を目的に作製したトランスジェニックツールの解析結果は国際誌にて報告した。②細胞膜におけるDeltaの分布を明らかにするため、免疫電顕の手法を専門家から教わり、観察（および解析）可能なサンプル作製の至適条件を見いだした。また、Deltaの分布も明らかになりつつある。以上①②で構築した実験手法は本研究の要となるもので、初年度でこれらを確立し、さらにその解析に進んだことは本研究が着実に進展していることを意味している。
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| Strategy for Future Research Activity |
「運命選択」と「細胞間接触の履歴」の関係性・法則性を明らかにする（本研究最大の目的）。研究実績の概要で記述した細胞間接触の可視化システムを利用して、任意の娘細胞が分化（Venus陽性）あるいは未分化（陰性）を選択する様子を観察すると同時に、娘細胞と近隣細胞との接触（娘細胞誕生から４時間以内の接触）を定量的に逐一見ていき対応付けを行う。この解析により、例えば「娘細胞が未分化を選択するには、○個の分化途上細胞と○○時間、○○平方マイクロメートル以上接触することが重要」などの法則性を見いだす。これにはDeltaの（三次元的）分布情報が必要であるため、現在作成中の連続免疫電顕像をもとに3D再構成（およびその定量）を同時に行う。以上の内容をまとめ論文投稿する。
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Research Products
(9 results)
