薬剤耐性菌の耐性分子機構に基づいた迅速鑑別法の開発と評価

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14J05455
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 横山 覚 名古屋大学, 医学系研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2014-04-25 – 2017-03-31
• Keywords: 薬剤耐性菌 / 薬剤耐性機構

Outline of Annual Research Achievements

1)大腸菌ライブラリーの構築、2)薬剤感受性試験、3)酵素の精製を実施した。
1)当研究室に所有するOXY-型ベータラクタマーゼ産生株を対象として、PCR法にてOXY-型ベータラクタマーゼの保有を確認した。さらに、OXY-型ベータラクタマーゼ産生株においてダイレクトシーケンス法によりOXY-型ベータラクタマーゼの型別を実施した。阻害剤抵抗性の原因となるアミノ酸変異の同定を目的として、部位特異的変異導入法により大腸菌ライブラリーを構築した。
2)OXY-型ベータラクタマーゼ産生株と、構築したライブラリーに対する各種抗菌薬（ベータラクタム薬, ベータラクタマーゼ阻害剤）の最小発育阻止濃度を寒天平板希釈法により測定した。阻害剤抵抗性を示した株に関しては、PCR法によるOXY-型ベータラクタマーゼを検索した。阻害剤耐性を示し、かつPCR法によって検索されなかった菌に関して、新規OXY-型ベータラクタマーゼ遺伝子の探索を目的にクローニングを実施した。
3)当研究室が所有する菌株を用い、OXY-型ベータラクタマーゼの大量発現系作製とクロマトグラフィーシステムを用いた酵素精製方法を構築した。OXY-型ベータラクタマーゼ遺伝子をタンパク質の大量発現用ベクター（pET29a）に組み込み、BL21株を用いてクローニングすることで大量発現系を構築した。タンパク発現の誘導にはイソプロピル-ベータ-チオガラクトピラノシド（IPTG）を用いた。菌体の破砕には超音波破砕機を用いた。回収した上清からイオン交換クロマトグラフィーとゲルろ過クロマトグラフィーを組み合わせることで、90％以上の純度で酵素を精製した。野生型酵素とタンパク質の性質が異なる変異体酵素においては、精製過程の条件検討によって精製方法を最適化した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

１年目に計画していた研究計画を実施し遂行した。２年目に計画していた実施項目に着手できているのもあり、研究は概ね当初の研究計画通りに進行している状況にある。

Strategy for Future Research Activity

１年目に精製した酵素を酵素学的速度論で評価する。精製した酵素を結晶化し、その結晶のX線結晶構造解析することで酵素の立体構造決定を行う。得られた立体構造情報とケムインフォマティクスを利用して、OXY-型ベータラクタマーゼの阻害剤抵抗性の一因を原子レベルで明らかにするとともに、新規阻害剤の探索を行う。探索した阻害剤を用いて新規検査法を確立する。