2014 Fiscal Year Annual Research Report
小分子によるＲＮＡシュードノット構造の形成と遺伝子発現制御への応用
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14J05460
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
松本 咲 大阪大学, 理学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2014-04-25 – 2017-03-31
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| Keywords | RNA結合性分子 / シュードノット / フレームシフト / 遺伝子発現制御 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
合成小分子NCTnによるフレームシフト効率の変化を調べるため、ウミシイタケのルシフェラーゼとホタルのルシフェラーゼの間に、滑り配列、終止コドン及びNCTn誘起型シュードノット配列を導入した、dual-luciferaseプラスミドを構築した。このプラスミドをトランスフェクションしたHeLa細胞及びHEK293細胞にNCTnを添加し、それぞれのルシフェラーゼ活性からフレームシフト効率を算出し議論した。その結果、NCTn結合部位であるCGG/CGG配列を有するコンストラクト(M1-VPK, M2-VPK)をトランスフェクションした細胞にNCTnを添加した時、フレームシフト効率の上昇が観測された。一方、化合物の有無に関わらずシュードノット構造を形成するコンストラクト、F-VPKでは化合物を添加してもフレームシフト効率の上昇は観測されなかった。これらの結果より、NCT8はヒト細胞内においてもCGG/CGG配列に作用し、フレームシフト効率を上昇させることが明らかになった。
更に、NCT誘起型フレームシフトを用いて、タンパク質の局在化制御を試みた。ミトコンドリア局在化シグナルとEmGFPをフレームシフト配列の前に、mCherryを後に導入したコンストラクトを作製した。NCT8添加によるそれぞれのタンパク質の局在は、共焦点顕微鏡により観察した。その結果、M1-VPKとM2-VPKのコンストラクトを導入した細胞では、NCT8の添加により、mCherryの発現及びミトコンドリアへの局在が観測された。これより、NCT8誘起型フレームシフトを用いて、様々なタンパク質の発現制御を小分子で行えることを実証した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでに合成小分子ナフチリジンカルバメートテトラマー(NCTn)が－１リボソームフレームシフトを制御し得ることを無細胞翻訳系において確認している。これを踏まえ、平成26年度はNCTnによる－１リボソームフレームシフトの制御がヒト細胞内でも制御できるのかを調べた。レニーラルシフェラーゼとファイアフライルシフェラーゼの間にフレームシフトを引き起こすのに必要不可欠なすべり配列とNCTn誘起型シュードノット配列を導入したプラスミドをHeLa細胞及びHEK293細胞へトランスフェクションした。その後、NCT8を添加し、フレームシフト効率の変化をルシフェラーゼの活性により評価した。その結果、細胞内においても、NCTnはCGG/CGG配列に作用し、－１リボソームフレームシフトを引き起こすことが明らかになった。更に、レポーター遺伝子を蛍光タンパク質やオルガネラ局在化シグナルに変換することで、様々なツールとして有用であることも示すことができたため、当初の研究目的以上を達成できたと考える。
一方、NCTnより優れた化合物の創製に関して、NCTnよりも細胞毒性の低い化合物を得るため、NCTn誘導体を種々設計した。NCTnの二つのナフチリジン環を6-メトキシピリジンに変換した化合物の合成を達成した。また、NCTnの二つのナフチリジン環をfuro[2,3-b]pyridineに変換した化合物を設計し、現在合成を進めている。
これより、本研究課題の当初研究目的の達成度はおおむね順調に進展していると評価する。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに合成小分子ナフチリジンカルバメートテトラマー(NCTn)がヒト細胞内において－１リボソームフレームシフトを制御し得ることを明らかにしている。今後、CGG/CGG配列をAAA/AAAに変異させたコンストラクトを用いて化合物が非特異的にフレームシフト効率を上昇している可能性について検討する。また、滑り配列の上流のレポーター遺伝子の３末にストップコドンを導入したコンストラクト及び、滑り配列を改変させたコンストラクトを作製し、NCTnがフレームシフトを起こしたことにより、下流のレポーター遺伝子の発現が上昇したことを示す。更に、細胞抽出液を用いてウェスタンブロッティングを行うことにより、NCTnが細胞内でフレームシフトを制御していることをより確実に実証する。
また、無細胞翻訳系を用いて翻訳を行ったそれぞれのタンパク質をSDS-PAGEにより分離
した後CBB染色もしくは銀染色を行い、切り出し、LC-MS/MSを用いて、フレームシフトが起こっていることを明確に示す。
NCTnより優れた化合物の創製を目指す。NCTnより細胞透過性が高く、細胞毒性の低く、そして分子量の小さい分子の創製を目指し、種々のNCTN誘導体の設計・合成を行う。NCTnの二つのナフチリジン環をfuro[2,3-b]pyridineに変換した化合物の合成を達成する。合成した化合物を用いた細胞内での－１リボソームフレームシフトアッセイを行い、化合物の性能を検討する。
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Research Products
(5 results)
