2015 Fiscal Year Annual Research Report
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14J07468
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| Research Institution | National Institute of Genetics |
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Principal Investigator |
太田 緑 国立遺伝学研究所, 分子遺伝研究系, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2014-04-25 – 2017-03-31
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| Keywords | 中心体 / 中心小体 / 中心体複製 / Plk4 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は中心体複製開始点における分子基盤を解明することを目的とし、複製初期に必須のPolo-like キナーゼ4(Plk4)、STIL、HsSAS-6の3因子がどのように相互作用して複製開始点を制御するのかということに主眼を置く。中心体は1対の母・娘中心小体から構成され、その複製過程は母中心小体の基部から娘中心小体の前駆体構造が1つのみ形成されることで開始し、娘中心小体の伸長を経て完了する。 当該年度の研究実績状況は以下の通りである。
1) 超解像顕微鏡を用いた中心体複製開始点の解析
娘中心小体が常に1に限定される分子機構を明らかにするために、超解像顕微鏡を用いて複製開始領域の観察を行った。この際、あらかじめ複製開始点を1に限定する局在の非対称性が見られるかに着眼点をおいて解析した。複製開始領域となる母中心小体の基部に、複製開始前から局在するCep192, Cep152, Plk4の局在を観察した結果、Plk4のみに非対称性がみられ、この非対称性が複製開始点を1に限定する制御機構ではないかと考えられた。
2) 娘中心小体から複製開始点のPlk4へのフィードバック機構の解析
これまでPlk4の局在を限定するには、複製開始時にSTILが娘中心小体への局在することが必要であることを見出してきた。この分子機構を調べるために、STILがPlk4の自己リン酸化やタンパク質の安定性に与える影響を生化学的および細胞生物学的に解析した。その結果、STILのC端側の保存された領域にPlk4の自己リン酸化制御に関わる領域があることが示唆された。したがって、STILはPlk4と直接結合して娘中心小体を形成すると同時に、そのC端側によってPlk4の自己リン酸化を誘発し、不必要なPlk4の分解を導くことで、娘中心小体の数を限定しているのではないかと考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ヒト培養細胞をモデルとし、生化学的手法を用いて中心小体構成因子の分子間相互作用の解析、および超解像顕微鏡観察をベースとした細胞生物学的手法を用いて因子群の細胞内動態解析を重点的に進めた。これらにより、現在は中心小体複製制御の原理に迫る分子機構を明らかにしつつある。具体的には、中心小体複製に必須の因子であるPLK4/STIL/HsSAS-6における分子間相互作用、複合体形成、リン酸化制御の詳細を明らかにし、新たに複製される中心小体が１コピーに限定される分子機構をモデル化する段階にまで至っている。以上の結果は、国内の主要学会で発表され、日本細胞生物学会では口頭発表を行い、若手優秀発表賞を受賞した。国外の当該分野をリードする研究室でもセミナーを行い、インフォーマルではあるが国際的にも高い評価を既に受けている。以上のように、本研究は順調に進展しており、現在これまでの結果を論文としてとりまとめ、投稿準備中であり、インパクトの高い国際誌に早期に発表予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究では中心体複製の初期に必須であるPlk4、STILおよびHsSAS-6の3因子に注目し、これらがどのように相互作用して複製開始点を制御し得るのかに主眼を置いて行っている。採用１年目において、これら3因子の分子間相互作用を明らかにし、中心体の複製開始の分子メカニズムと、中心体の複製開始点が1箇所に限定されるフィードバック機構の存在を明らかにした(Ohta et al.,Nat.Comm.,2014)。採用2年目は、中心体の複製開始点が1箇所に限定される分子機構の解明を目指して、 超解像顕微鏡を用いた中心体複製開始点の局在観察と、生化学的な解析をおこなった。その結果、(1)複製開始の鍵となるPlk4の局在が複製開始領域に非対称な局在を示すこと、(2)中心体の複製開始点が1箇所に限定されるフィードバック機構として、複製前駆体の構成因子であるSTILのC末領域が重要であることを見出した。3年目の28年度は、(1)のPlk4局在の非対称性がどのような位置情報をもとに形成されるのか、またその非対称性を作り出す分子機構を解析するため、始めに超解像顕微鏡を用いた多色観察を行い、続いてCrisper/Cas9を用いた内在性因子の蛍光標識株を作製し、生細胞観察を行う予定である。さらに、Plk4の非対称性局在が細胞周期のどの時期に生じるのかを調べるために、細胞周期を通じてPlk4の局在を観察する。また、(2)で明らかになったSTILのC末領域の詳細な分子機構を調べるため、組み換えタンパク質を用いた生化学的な解析と、細胞内における変異体の解析を行う予定である。これらの解析から、中心体複製開始点が1つに限定される仮説モデルを構築し、その妥当性を検討していく予定である。
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[Journal Article] CDK1 prevents unscheduled PLK4-STIL complex 1 assembly in centriole biogenesis2016
Author(s)
Sihem Zitouni, Maria E. Francia, Filipe Leal, Susana Montenegro Gouveia, Catarina Nabais, Paulo Duarte, Samuel Gilberto, Daniela Brito, Tyler Moyer, Steffi Kandels-Lewis, Midori Ohta, Daiju Kitagawa, Andrew J. Holland, Eric Karsenti, Thierry Lorca, Mariana Lince-Faria, Monica Bettencourt-Dias
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Journal Title
Current Biology
Volume: Vol. 26
Pages: 1127-1137
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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