2014 Fiscal Year Annual Research Report
クロマチンタンパク質のユビキチン修飾を介した維持ＤＮＡメチル化制御機構の解析
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14J07515
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
山口 留奈 名古屋市立大学, 医学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2014-04-25 – 2017-03-31
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| Keywords | DNAメチル化 / DNA複製 / Dnmt1 / Uhrf1 / Usp7 / ユビキチン / クロマチン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
DNAのメチル化は、エピジェネティック情報の一つとして細胞固有の遺伝子発現や形質制御に重要であり、個体の正常な発生や細胞分化に関与する。本研究では、維持メチル化の過程でUhrf1依存的に生じるヒストンH3およびPCNAのユビキチン化/脱ユビキチン化制御の分子機構の解明および細胞の生存に与える影響を明らかにすることを目的とする。
DNAのメチル化パターンはDNA複製を介して親鎖から娘鎖へと、メチル化酵素Dnmt1により正確に継承される必要がある。我々はこれまでにアフリカツメガエル卵を用いた無細胞系での解析により、ヘミメチル化DNA結合タンパク質Uhrf1によるH3K23のユビキチン化が、Dnmt1の同部位への集積に重要であることを報告してきた。またDNA複製の完了に伴い、Dnmt1のクロマチンからの解離とともにH3の脱ユビキチン化が起こることが分かっているが、この詳細は不明である。
H3の脱ユビキチン化がDnmt1の解離とともに起こることに注目し、カエル卵抽出液を用いてDnmt1に結合する脱ユビキチン化酵素を質量分析にて探索したところUsp7を同定した。そこでUsp7のクロマチン結合を調べると、複製依存的かつDnmt1およびUhrf1依存的に結合することが分かった。興味深いことに、Usp7を卵抽出液より特異抗体を用いて免疫除去したとき、Dnmt1のクロマチン結合の増強およびH3の弱いユビキチン化が見られた。続いてin vitroの脱ユビキチン化アッセイにより、Usp7が直接ヒストンH3を脱ユビキチン化する活性について検討したところ、加えたリコンビナントUsp7の濃度依存的にH3のユビキチン化の減少が見られた。
以上の結果から、Usp7はヘミメチル化部位ではたらく脱ユビキチン化酵素の一つとしてヒストンH3の脱ユビキチン化を介してDnmt1のクロマチン結合能を制御するものと考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
我々はこれまでに、アフリカツメガエル卵抽出液を使った無細胞系において維持メチル化が再現可能であることを示してきた。これにより維持メチル化の過程において、Uhrf1依存的なヒストンH3K23のユビキチン化を介してDnmt1がヘミメチル化部位へと集積することを明らかにしており、これはDNA複製の終了にともないクロマチンから解離し、同時にH3の脱ユビキチン化が起こることを見出した。この脱ユビキチン化酵素の候補として、Dnmt1に結合するUsp7を同定し機能解析を行ったところ、Usp7は複製依存的かつDnmt1およびUhrf1依存的にクロマチンに結合し、卵抽出液からのUsp7を免疫除去ではDnmt1およびユビキチン化H3のクロマチン上への過剰な蓄積が見られた。また、Usp7によるH3の脱ユビキチン化活性についてもin vitroアッセイ系において確認できた。
以上より、カエル卵抽出液を使ったアッセイ系での実験は当初の計画通り進行しており、今後はこれがヒトでも保存された現象であるかを検討していく。ヒト培養細胞におけるノックダウンの準備およびノックアウトマウスの用意も徐々に進んでおり予備実験を既に始めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、前年度に得られた知見をもとに培養細胞を用いた実験を行い、カエル卵抽出液内で見られた現象がヒトでも保存されうるか検討する。特にDnmt1ノックダウンに伴う細胞死に注目して解析を進める。Uhrf1, Dnmt1, Usp7に特異的なshRNAによって内在性のタンパク質を様々な組み合わせでノックダウンし、ヒストンH3およびPCNAのユビキチン化状態、細胞増殖への影響を調べる。
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