2015 Fiscal Year Annual Research Report
補体Ｃ１ｑによるシナプス除去機能の新規制御メカニズムの解明
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14J07587
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
鈴木 邦道 慶應義塾大学, 医学部, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2014-04-25 – 2017-03-31
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| Keywords | 補体 / C1q / シナプス / AMPA受容体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
＜補体の局在とシナプス除去現象＞
免疫組織学的検討により、補体C1qが海馬CA2や脳の局所に観察される原因として、細胞外マトリックスに結合している可能性を明らかにした。それぞれある種の糖鎖構造と共局在しており、糖鎖を分解する酵素のin vivoでの投与により糖鎖構造およびC1qのシグナルが消失していた。この知見はin vitroの神経細胞とグリア細胞との共培養系でも確認できており、C1qの局在についての時空間制御機構を探索できるようになった。機能的意義の検討として、子宮内電子穿孔法により大脳バレル皮質の神経細胞にGFPを遺伝子導入し樹状突起の形態を観察する実験系を確立した。初期検討では補体欠損マウスでは樹状突起の刈り込み現象に異常がある可能性が見出されている。
＜シナプス形成の制御分子＞
小脳顆粒細胞-プルキンエ細胞間のシナプス喪失により運動失調を呈するCbln1KOマウスおよびGluD2KOマウスに対して、Cbln1のNeurexin結合ドメインとNeuronal Pentraxin1のAMPA受容体結合ドメインとを繋げたキメラ分子、Cerebellin-Pentraxin (CPTX)を小脳に投与すると運動失調が回復する現象に対して、運動機能の定量的な観測・解析を行った。また、電子顕微鏡による解析により喪失していたシナプスの部分的な回復を観測した。一方で、シナプス形成を解除する制御分子として、Cbln1のNeurexin結合ドメインのみを発現するタンパク質を作製し、Cbln1と競合しうる機能を有することを見出した。またこの分子は特定のNeurexinアイソフォームを検出しうるプローブとしても機能することが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究年次計画において、メカニズム探索のうち昨年まで見出すことができていなかったC1qの神経細胞に結合する条件設定が確立され、C1qが特定のコンパートメントに結合することを見出すことができた。受容体としてのコアタンパクは同定されていないが、特定の糖鎖パターンを認識しているという重要な知見を得た。またミクログリアによる貪食能を評価する系が立ち上げられており、ミクログリアが「いつ」「どのように」「どのシナプスを」除去するかについてメカニズムに迫ることができると考えている。さらin vivoで樹状突起の刈り込み現象を検討できる実験系を確立し、補体欠損マウスでの変化を観察で切るようになった。
年次計画のシナプス形成の制御分子の作製・評価については、昨年に引き続き共同研究のもとで検討が行われた。in vivoにおいて作製したシナプス形成分子の投与により、シナプス喪失に伴う運動失調を回復させることが観察され、また電子顕微鏡による形態学的な回復を伴っていることも観察されている。
以上の研究状況から、研究実績として概ね順調に進展していると思われる。
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| Strategy for Future Research Activity |
＜メカニズム探索＞C1qが糖鎖を認識するという観測に基づき、レクチンアレイにより認識される糖鎖パターンを網羅的に解析し、受容体を同定する。また過去の知見に基づき、受容体候補となるコアタンパク質を過剰発現させての結合アッセイを行う。
＜シナプス除去の検出・動態と相互作用解明＞子宮内電気穿孔法を用いてバレル皮質での神経細胞樹状突起の形態を野生型と補体KOマウスで比較する。またミクログリアにより貪食がどのように制御されているかを、薬理学的なミクログリアの除去や、貪食過程のライブイメージングや免疫染色により検討する。現在、補体floxマウスの作製をしており、それが利用可能となれば細胞特異的欠損マウスでの解析を行うことで、C1qの分泌・機能に重要な細胞を同定する。
＜シナプス形成/除去の制御分子＞シナプスコネクターについては誘導されたシナプス形成が機能的に作動しているか、可塑性に影響を与えているか否かを非神経細胞との人工シナプス誘導系またはin vivoでのコネクターを投与した小脳急性スライスを用いて検討する。
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