2014 Fiscal Year Annual Research Report
電気化学高速ＡＦＭと構造解析を用いた新規キノヘモプロテインの電子移動機構の解析
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14J08641
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
武田 康太 東京農工大学, 大学院工学府, 特別研究員(DC2)
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| Project Period (FY) |
2014-04-25 – 2016-03-31
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| Keywords | 酸化還元タンパク質 / 電子移動 / PQQ / ヘム / セロビオース脱水素酵素 / 糖質関連酵素 / 生物電気化学 / 高速AFM |
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| Outline of Annual Research Achievements |
担子菌Coprinopsis cinerea由来のピロロキノリンキノン(PQQ)依存性新規ピラノース脱水素酵素(CcPDH)の全長酵素及び、各ドメインをそれぞれ切り離した組換え体を用いてその酵素学的性質を明らかとした。特徴的な性質として、逆いす形配座の立体配置をとる単糖に対して認識すること、セロビオース脱水素酵素のヘムドメインと類似した性質を有していること、さらにセルロースへの強い吸着能があることがわかった。
種々の電子受容体を用いて本酵素の電子伝達能を検討した結果、各ドメインで至適pHが異なることを見出した。全体の電子伝達反応のなかで、分子内電子移動が反応の律速となっており、pHに依存していることが考えられた。電気化学測定により酵素内のPQQとヘムの酸化還元電位を決定することに成功し、本酵素の分子内電子移動機構が電位差によって制御されていることを示唆する結果を得た。
酸化還元反応に伴うタンパク質一分子の動的挙動を直接観察するために、金沢大との共同研究を遂行し、電気化学計測と高速原子間力顕微鏡(HS-AFM)の同時測定が可能な電気化学HS-AFM装置の構築をした。本手法により、電子伝達タンパク質であるシトクロムcの吸着挙動と電気化学応答の相関について新しい知見得るとともに、バイオエレクトロニクス研究において非常に有用な解析ツールであることを示した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度に予定していた野生型CcPDH及びその変異酵素の大量生産を達成した。これらの組換え体を用いて、酵素中のPQQとヘムの酸化還元電位を決定することに成功し、電子移動反応を解析する上で重要となる熱力学的パラメーターを明らかにした。次に電極上における本酵素の一分子観察を可能にする電気化学高速AFM装置を構築し、シトクロムcを用いて本手法が有用であることを示す研究成果を得ることができた。次年度に行う予定であるPQQドメインとシトクロムドメインの複合体結晶に関しても、CBMドメインを欠損させた組換え体の大量生産及び精製を完了していることから、研究計画は概ね順調に進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
大量に生産した野生型と変異酵素を用い、ストップトフロー分光光度計によりPQQドメインからシトクロムドメインへの分子内電子移動速度を算出する。また電気化学高速AFM装置を用いて、酸化還元反応に伴う一分子の動態観察を試みる。過渡的複合体結晶の構造解析については結晶化条件を探索し、構造解析を行う予定である。それによりこれまでに得られた酵素学的知見と合わせて、CcPDHの電子移動反応機構について明らかとする。
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| Remarks |
新聞報道 科学新聞 2015年3月6日8面 生体分子の挙動直接観察できるAFM装置開発
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Research Products
(18 results)
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[Journal Article] A novel pyrroloquinoline quinone-dependent 2-keto-D-glucose dehydrogenase from Pseudomonas aureofaciens2015
Author(s)
K. Umezawa, K. Takeda, T. Ishida, N. Sunagawa, A. Makabe, K. Isobe, K. Koba, H. Ohno, M. Samejima, N. Nakamura, K. Igarashi, M. Yoshida
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Journal Title
J. Bacteriol.
Volume: 197
Pages: 1322-1329
DOI
Peer Reviewed
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