2014 Fiscal Year Annual Research Report
動物細胞内シグナル伝達におけるカルシウム応答性アダプタータンパク質の機能解析
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14J09452
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
京 卓志 名古屋大学, 生命農学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2014-04-25 – 2017-03-31
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| Keywords | タンパク質間相互作用 / カルシウム結合タンパク質 / 小胞輸送 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請書に沿って、ALG-2/ALG-2ホモ二量体、およびALG-2/peflinヘテロ二量体のカルシウム依存的な相互作用タンパク質を探索した。カルシウム結合能を失った変異体FLAG-ALG-2とALG-2（ホモ二量体）、あるいは同じく変異体FLAG-ALG-2とpeflin（ヘテロ二量体）を共発現させたHEK293細胞溶解液を用いて、カルシウム存在下、抗FLAG抗体による免疫沈降を行った後、EGTAによる溶出を行った。免疫沈降産物をSDS-PAGEで展開後、銀染色を行ったところ、ヘテロ二量体のサンプルにおいては特異的なバンドは検出されなかったが、ホモ二量体のサンプルにおいては特異的なバンドが多数検出された。比較的強く検出された４本のバンドについて、そのトリプシン消化産物をLC-MS/MSを用いて解析を行った。３つは既存のALG-2相互作用タンパク質であったが、新規なALG-2相互作用タンパク質としてTFGを同定した。次にGFP-TFGとFLAG-ALG-2を共発現させたHEK293細胞溶解液を用いて、抗GFP抗体により免疫沈降を行うことで、両者のカルシウム依存的な相互作用を確認した。TFGは小胞体上の特別な領域であるERES(endoplasmic reticulum exit sites)に局在し、小胞体からゴルジ体へのタンパク質輸送を担うタンパク質の一つである。小胞体からゴルジ体へのタンパク質輸送におけるTFGの役割は専らTFGの８量体形成能において論じられているのみである。本年度に明らかにしたTFGとALG-2とのカルシウム依存的な相互作用は、TFGの８量体形成によるタンパク質輸送制御に加え、カルシウムとALG-2によって担われるタンパク質間相互作用による新たな制御メカニズムを提供する可能性がある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ヘテロ二量体の相互作用タンパク質の同定には至らなかったが、ホモ二量体の新規相互作用タンパク質の同定に成功した。ごく最近では、変異体ALG-2を用いたTFGとの相互作用解析によってALG-2とTFGとの詳細な相互作用様式が明らかになりつつある。また、免疫染色と蛍光顕微鏡を用いた細胞内局在解析によって、TFGとALG-2がERESで共局在することが明らかになった。以上、相互作用タンパク質の同定と、それにとどまらずその相互作用様式の解析、および細胞内局在解析に着手している点において、現在のところおおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
ALG-2とTFGの相互作用が小胞体からゴルジ体へのタンパク質輸送に果たしている役割を明らかにするために以下の実験を計画している。
1.TFGの８量体形成におけるALG-2の関与を調べる。具体的には、ALG-2の発現抑制や、野生型ALG-2または変異体ALG-2の過剰発現がTFGの８量体形成に与える影響を調べる。2.TFGの細胞内局在におけるALG-2の関与を調べる。ALG-2の発現抑制や、野生型ALG-2または変異体ALG-2の過剰発現がTFGの細胞内局在に与える影響を調べる。3.ALG-2との相互作用能を失った変異体TFGの獲得を目指す。そのために、TFGのALG-2相互作用領域を同定し、その領域を欠損させた変異体を作成する。4.ALG-2やTFGの発現抑制、あるいは変異体ALG-2や変異体TFGの過剰発現が小胞体からゴルジ体へのタンパク質輸送に与える影響を調べる。
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Research Products
(3 results)
