2014 Fiscal Year Annual Research Report
非タンパク主鎖骨格ペプチドを合成可能な改変型リボソームの創製
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14J09520
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
藤野 公茂 東京大学, 総合文化研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2014-04-25 – 2017-03-31
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| Keywords | 翻訳 / リボソーム / 非タンパク質性アミノ酸 / ペプチド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、『D体アミノ酸、β-アミノ酸などの、主鎖骨格が特殊な非タンパク質性アミノ酸を自由に導入できる改変型リボソームを開発すること』を目的とする。リボソームは巨大分子であるため、活性中心の構造を計算して改変するのが難しい。そこで、本研究では、活性中心付近の塩基にランダム変異を加えた変異リボソームライブラリを作製し、その中から実験操作により目的のリボソームを選択するという手法を用いることとした。
当初の研究計画では、次のような段階的な目標を設定した。1.変異リボソームのライブラリ作製、2.非タンパク質性アミノ酸を導入可能な変異リボソームの選択、3.選択されたリボソームの性能評価、4.翻訳の正確性の低下した変異リボソームの除去、5.非タンパク質性アミノ酸の種類の拡張、の5段階である。
1年目である本年度は、1.変異リボソームのライブラリ作製を完了することを目標として研究を行い、実際には1.に加え、2.非タンパク質性アミノ酸を導入可能な変異リボソームの選択における選択条件の決定までを完了した。
1.変異リボソームのライブラリ作製：リボソームの活性中心付近の13塩基にランダム変異を加えたrDNAをプラスミドに組み込んだプラスミドライブラリを作製し、リボソームを発現・精製し、変異リボソームのライブラリを得た。
2.非タンパク質性アミノ酸を導入可能な変異リボソームの選択：変異リボソームのライブラリから目的のリボソームを選択する過程は、リボソーム提示法を用いる。まずは、リボソーム提示法により、特定のアミノ酸配列（実際の選択においては、非タンパク質性アミノ酸をコードする部分）を翻訳することができた変異リボソームのみを選択的に回収する手法の確立を目指した。翻訳反応やリボソームの回収条件について検討を行い、翻訳が可能な場合と不可能な場合で、リボソームの回収率に充分な差が得られる条件を決定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究を進めるに当たり、次のような段階的な目標を設定した。1.変異リボソームのライブラリ作製、2.非タンパク質性アミノ酸を導入可能な変異リボソームの選択、3.選択されたリボソームの性能評価、4.翻訳の正確性の低下した変異リボソームの除去、5.非タンパク質性アミノ酸の種類の拡張、の5段階である。研究当初、1年目には、上記目標の1. 変異リボソームのライブラリ作製までを完了する予定であった。しかし、実際には、本年度終了時点において、1.に加え、2.非タンパク質性アミノ酸を導入可能な変異リボソームの選択の途中段階である、選択に用いる条件の決定までを完了した。以上より、現在までの達成度としては、『概ね順調』（実際には少し予定よりも速く進行中）とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究では、次のような段階的な目標を設定した。1.変異リボソームのライブラリ作製、2.非タンパク質性アミノ酸を導入可能な変異リボソームの選択、3.選択されたリボソームの性能評価、4.翻訳の正確性の低下した変異リボソームの除去、5.非タンパク質性アミノ酸の種類の拡張、の5段階である。本年度終了時点において、1.に加え、2.非タンパク質性アミノ酸を導入可能な変異リボソームの選択の途中段階である、選択に用いる条件の決定までを完了した。現在、当初の計画の通りに研究は進行しており、次年度以降は、上記の計画に引き続き基づいて、研究を遂行して行く予定である。具体的には、本年度中に先駆けて決定した、リボソーム提示法の条件で選択操作を繰り返すことで、2.非タンパク質性アミノ酸を導入可能なリボソームの選択を実施する。変異リボソームが得られた後には、3.リボソームの性能評価、4.翻訳正確性の低いリボソームの除去を目指す。
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