細胞表現系を用いた特殊ペプチドスクリーニング技術の開発と応用

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14J09744
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 西尾 洸祐 東京大学, 理学系研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2014-04-25 – 2017-03-31
• Keywords: 結合ベーススクリーニング / 特殊ペプチドライブラリ

Outline of Annual Research Achievements

最終的な活性ベーススクリーニング達成のために、想定される問題点の解決および条件の最適化を行った。まず、特殊ペプチドライブラリを用いた場合の問題点として、１本の試験管内で1013種の特殊ペプチドを同時に合成出来る反面、各分子種濃度はaM~fM(アトモーラーからフェムトモーラー)程度でありオキシトシン受容体に対し活性を示さない可能性が高いと考えられる。そこで最初に合成されるランダムライブラリーから、オキシトシン受容体発現細胞株に結合する特殊ペプチドをスクリーニングした。これにより、オキシトシン受容体発現細胞株に結合する分子に限定された特殊ペプチドライブラリが構築され、分子種が減少した分各分子種の濃度が上がると考えた。
まず、オキシトシン受容体細胞株に結合する特殊ペプチドをスクリーニングするために、バッファー、温度、インキュベーション時間などのスクリーニング条件を最適化した。その後、オキシトシン受容体細胞株に結合する特殊ペプチドのスクリーニングを最適化した条件下で行った。具体的には、ランダム特殊ペプチドライブラリとオキシトシン受容体が発現していない細胞株を混合し、その細胞に結合する特殊ペプチドを取り除き、その後残りの特殊ペプチドとオキシトシン受容体細胞株を混合し、その細胞に結合する特殊ペプチドを回収した。回収された特殊ペプチドのcDNAをPCR増幅・転写・翻訳し特殊ペプチドへと再変換した。この一連の操作を繰り返し、オキシトシン受容体発現細胞株のみに結合する特殊ペプチドからなるライブラリの構築を行った。これにより、活性ベースのスクリーニングを行うための準備が整った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

特殊ペプチドライブラリを用いた活性ベースのスクリーニングを確立し、オキシトシン受容体を活性化する分子を獲得するため、想定される問題点の解決策の模索、実験条件の最適化を行いながら段階的に研究を進めている。
現在までは、活性ベースのスクリーニングを行う準備を行ってきた。まずは、活性ベースのスクリーニングの成功率を上げるために、ランダムな特殊ペプチドライブラリからオキシトシン受容体発現細胞株に結合する分子のみをスクリーニングすることで、オキシトシン受容体を発現している細胞にのみ結合する特殊ペプチドのみからなるライブラリを構築し、各種の特殊ペプチドのライブラリ中濃度を高めた。この結合ベースのスクリーニングを行うにあたって、様々な条件検討を行い、結合ベースのスクリーニングまで完了した。

Strategy for Future Research Activity

今後は、オキシトシン受容体結合特殊ペプチドライブラリを用いて、オキシトシン受容体を活性化する分子を活性ベースのスクリーニングで獲得することを目指す。スクリーニングによってオキシトシン受容体を活性化する特殊ペプチドが同定されたら、そのペプチドのオキシトシン受容体に対する活性の定量的な評価および生理活性評価を行う。その後、必要に応じてそのペプチドのオキシトシン受容体に対する活性や生理活性を向上させるため、構造の最適化をしていく。