2014 Fiscal Year Annual Research Report
網羅的オルガネラ解析ツールＲａｂを用いた新規ＲＮＡサイレンシング制御機構の解明
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14J10075
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
小林 穂高 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 特別研究員(SPD)
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| Project Period (FY) |
2014-04-25 – 2017-03-31
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| Keywords | RNAサイレンシング / RISC / Argonaute / miRNA / オルガネラ / Rab |
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| Outline of Annual Research Achievements |
RNAサイレンシングとは、20~30塩基の小分子RNAによって、そのRNAと相補的な塩基配列を持つ遺伝子の発現が抑制される現象である。小分子RNAの一つであるmicro RNA（miRNA）はヒトゲノムに約1,000種類もコードされており、タンパク質をコードする全遺伝子の約1/2の発現を制御していると考えられている。従って、RNAサイレンシング制御機構の解明は、生命の根幹である遺伝子の発現制御を理解する上で重要である。miRNAはArgonauteと呼ばれるタンパク質に取り込まれ、RNA-induced silencing complex（RISC）と呼ばれる複合体を形成することで、RNAサイレンシングを実行する。近年、RISCが後期エンドソームと呼ばれるオルガネラに局在すると、RNAサイレンシングが促進されることが報告された。従って、RISCとオルガネラの相互作用という細胞生物学的な視点が、RNAサイレンシングの制御機構を明らかにする上で、今後重要になると考えられる。しかし、RISCが局在するオルガネラの全容や、RISCがオルガネラに局在する意義は依然として明らかでない。そこで、本研究では、Rabファミリータンパク質を網羅的オルガネラ解析ツールとして用いることで、RISCが局在するオルガネラの全容と、それぞれのRISC陽性オルガネラのRNAサイレンシングにおける機能の解明を目指す。本研究では、これによって、RISCとオルガネラの相互作用という新しい視点から、オルガネラを介した新規RNAサイレンシング制御機構を解明することを目的としている。初年度ではまず、RISCが局在するオルガネラの探索を試みた。その結果、RISCの細胞内局在が未同定の要因によって変化する可能性を示唆する結果を得ることができた。今後、RISCが局在するオルガネラの探索をさらに進めて行く予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請時の研究計画１-４のうち、１を実施中である。また、その過程で予想外の興味深い結果を得ている。
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| Strategy for Future Research Activity |
初年度ではまず、RISCが局在するオルガネラの探索を試みた。これまでの先行研究により、RISCは細胞内で複数のドット状のコンパートメントに局在することが明らかになっている。このRISC陽性のドットは、P-bodyと呼ばれる非オルガネラ性のドットとGW-bodyと呼ばれるドットから成り、GW-bodyの一部は後期エンドソームに局在することが報告されている。HeLa細胞において、RISCの構成因子であるArgonauteを免疫染色法により可視化したところ、実際にArgonauteがドット状のコンパートメントに局在することが確認された。一方、RNAi干渉法によりArgonauteの発現量を減少させた細胞では、このドット状のシグナルは観察されなかった。従って、本実験条件下では、Argonauteの細胞内局在を正しく可視化出来ていると考えられる。そこで次に、蛍光タンパク質を付加したRab（Rab1A, Rab2A, Rab3A, Rab4A, Rab5A, Rab6A, Rab7, Rab8A, Rab9A, Rab10, Rab11A）をオルガネラマーカーとして利用し、ArgonauteとRabの共局在性を検証した。その結果、上記のRabは小胞体・ゴルジ体・初期エンドソーム・後期エンドソーム・リサイクリングエンドソーム・リソソームといった様々なオルガネラに局在するにも関わらず、ArgonauteはいずれのRabとも共局在性を示さなかった。以上の結果は、RISCが後期エンドソームに局在するという先行研究と相反するものであり、Argonauteの細胞内局在が組織・細胞種・培養条件といった要素によって様々に変化する可能性を示唆している。今後、今回使用したRabでは可視化されないオルガネラについても可視化することで、RISCが局在するオルガネラの探索をさらに進めて行く予定である。
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