2014 Fiscal Year Annual Research Report
オプトジェネティクス技術を用いた反芻家畜における卵胞発育制御メカニズムの解明
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14J10480
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
末富 祐太 名古屋大学, 生命農学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2014-04-25 – 2017-03-31
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| Keywords | KNDyニューロン / アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター / Creリコンビナーゼ / チャネルロドプシン（ChR2） / アーキアロドプシン（ArchT） |
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| Outline of Annual Research Achievements |
「視床下部弓状核KNDyニューロンが、卵胞発育を促すGnRHパルスの発生中枢である」という仮説を証明するために、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを用いた遺伝子導入により、KNDyニューロン特異的にチャネルロドプシン（ChR2）またはアーキアロドプシン（ArchT）を発現する遺伝子導入ヤギを作出している。
今年度は、AAVベクターを作製するのに必要なDNAコンストラクトの作製を進めた。loxP配列で挟まれたChR2またはArchT遺伝子がプロモーターの下流に逆向きに挿入されたプラスミドベクターを作製した。ChR2とArchTをKNDyニューロン特異的に発現させるために、KNDyニューロンのみに発現するTAC3遺伝子のプロモーターの制御下でCreリコンビナーゼが発現するAAVベクターの作製も開始した。ヤギ視床下部神経細胞株を用いたルシフェラーゼアッセイを行い、ヤギTAC3の-834～+166領域が十分なプロモーター活性を有することを確認した。現在、この領域の下流にCreリコンビナーゼ遺伝子をもつAAVベクターを作製している。
さらに、ヤギ弓状核にAAVベクターを注入する方法を検討した。染色液注入により、注入液量や流速などのヤギ弓状核への最適な注入条件を確立した。次に、4種の血清型（AAV-1, 2, 5, DJ）のAAVベクターを注入し、AAV-1およびDJがヤギ脳内への遺伝子導入に適した血清型であることを特定した。また、ヤギ脳内に注入したものと同一の4種のAAVベクターを、ヤギ視床下部神経由来細胞株に感染させたところ、AAV-2、5およびDJで遺伝子導入効率が高いことが確認された。今後、生体内外で遺伝子導入が確認されたAAV-DJを、ヤギ脳内への遺伝子導入に用いる予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究計画では、今年度にAAVベクターの作製とヤギ弓状核へのAAV注入条件の検討を実施する予定であった。目的のヤギ作出に必要なAAVベクター作製にあたって、ChR2またはArchT遺伝子を発現するDNAコンストラクト作製を完了している。また、ヤギ作出で使用するプロモーター領域を決定し、この領域を含むAAVベクターを生成するのに必要なプラスミドベクターを現在作製中である。さらに、AAVベクターによりヤギ脳内に遺伝子を導入する方法を検討した。まず、染色液を用いて、ヤギ脳への最適な注入条件を決定した。次に、4種類の血清型のAAVベクターを実際にヤギ脳内に注入し、ヤギ脳内に遺伝子導入するのに最適な血清型を特定した。以上の通り、すべてのAAVベクターの作製が終了しているわけではないが、おおむね目的を達成できており、次年度中には目的のヤギの作出を完了する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の推進方策は、ChR2またはArchT遺伝子をKNDyニューロン特異的に発現する遺伝子導入ヤギの作出を進め、完了させることである。目的のヤギ作出に必要なAAVベクター作製を早期に完了し、次年度中に目的のヤギを完成させることを目標とする。
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[Journal Article] The Luteinising Hormone Surge-Generating System is Functional in Male Goats as in Females: Involvement of Kisspetin Neurons in the Medial Preoptic Area2015
Author(s)
F. Matsuda, K. Nakatsukasa, Y. Suetomi, Y. Naniwa, D. Ito, N. Inoue, Y. Wakabayashi, H. Okamura, K.-I. Maeda, Y. Uenoyama, H. Tsukamura and S. Ohkura
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Journal Title
Journal of Neuroendocrinology
Volume: 27
Pages: 57-65
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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