カスパーゼ１活性化のアウトプットを制御する分子機構およびその生理的意義の解明

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14J12382
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 劉 霆 東京大学, 薬学系研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2014-04-25 – 2017-03-31
• Keywords: カスパーゼ１ / インフラマソーム / 炎症性細胞死 / 非定型分泌 / 慢性炎症

Outline of Annual Research Achievements

カスパーゼ１はマクロファージなどの免疫担当細胞において、様々なストレスに応答し形成されるタンパク質複合体インフラマソーム内で活性化し、炎症性サイトカインIL-1βの分泌および炎症性細胞死の実行を制御していることが知られている。しかしながら、単一細胞レベルでこの２つのアウトプットがどのように制御されるかについてはほとんど明らかになっていない。本年度私は、この点を明らかにするため、カスパーゼ１活性を可視化するプローブSCAT1の技術と、理化学研究所・統合生命科学研究センターの小原收グループディレクター、白崎善隆研究員らが開発した単一細胞からのタンパク質分泌をリアルタイムに可視化するシステムを組み合わせ、カスパーゼ１活性化とそのアウトプットである炎症性サイトカインIL-1β分泌の同時イメージングを行った。その結果、インフラマソーム活性化刺激により、マクロファージ内でカスパーゼ１が活性化し、直後にIL-1βが細胞外に分泌され（バーストする）、その後細胞死が引き起こされる様子が観察された。このIL-1β分泌は主に死細胞から観察され、カスパーゼ１活性阻害剤によって抑制された。これらの結果は、細胞死を引き起こすような強い刺激を受けた細胞でIL-1β分泌が全か無かのデジタルな様式で制御されていることを示している。以上の内容は、前年度までの研究成果と共に米国科学雑誌「Cell Reports」に発表された。
また、カスパーゼ１活性化のアウトプット、特に炎症性細胞死を制御する分子機構を明らかにするため、化合物ライブラリーを用いたスクリーニング系の構築にも成功した。具体的には、SCAT1発現腹腔マクロファージに対しインフラマソーム活性化刺激を与えることで引き起こされる炎症性細胞死を、ArrayScanと呼ばれる全自動細胞イメージアナライザーによって検出する系である。今後はこの系を用いた網羅的スクリーニングを進める予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本年度は、前年度までの研究課題である「単一マクロファージでのインフラマソーム刺激によるカスパーゼ１活性の可視化」および「カスパーゼ１活性化アウトプットの単一細胞レベルでの制御機構の解明」をまとめ、論文として発表することに多くの時間を費やした。そのため、当初の研究目的である、カスパーゼ１活性化のアウトプットを制御する分子の同定までは達成できなかったが、初代培養マクロファージを用いた化合物スクリーニングの系を立ち上げることに成功した。また、化合物を用いた網羅的スクリーニングと並行して、カスパーゼ１の基質からそのアウトプットを制御する分子を探索する候補スクリーニングも行っている。したがって、当初の研究計画よりやや進行が遅れているものの、次年度に向けた準備をしっかり実行できたと考えている。

Strategy for Future Research Activity

今後は、本年度立ち上げに成功したSCAT1発現初代培養マクロファージを用いたハイスループットな自動解析系をもとに化合物スクリーニングを行い、カスパーゼ１活性化のアウトプットを制御する化合物・分子の同定を目指す。 スクリーニングに用いる化合物ライブラリーは東京大学創薬機構のValidated Compound Libraryを予定している。このライブラリーは既知活性化合物とoff patent医薬品から構成されており、候補化合物同定後のターゲット分子の同定が簡便であると考えられる。
一次スクリーニングでは、インフラマソーム-カスパーゼ１経路活性化のアウトプットである細胞死を指標に、細胞死を抑制するあるいは促進する化合物を候補化合物として絞り込む。二次スクリーニングでは疑陽性を排除するため、候補化合物単独投与がマクロファージに与える影響を検討する。三次スクリーニングでは、前記のスクリーニングで得られた候補化合物について、SCAT1発現マクロファージを用いたライブイメージング解析を行うことで、実際にインフラマソーム-カスパーゼ１経路に関与するかを検討する。また、ウエスタンブロットやELISAといった生化学的手法によって、候補化合物がIL-1β分泌に影響を与えるかについても同時に検討する。その後、最終的に得られた化合物についてそのターゲットタンパク質を同定する。
同定されたタンパク質について、生化学的・分子生物学的・免疫学的手法を駆使しその機能を明らかにすることで、カスパーゼ１活性化のアウトプットを制御する分子機構の解明に繋げる。また、同時に遺伝学的・薬理学的手法により、得られた分子あるいは化合物がインフラマソーム-カスパーゼ１経路が関与する生体反応にどう影響を与えるかについて検討することで、カスパーゼ１活性化アウトプットの生理的意義を明らかにする。

Research Products

• [Journal Article] Single-Cell Imaging of Caspase-1 Dynamics Reveals an All-or-None Inflammasome Signaling Response. (2014)
  • Author(s): Liu, T., Yamaguchi, Y., Shirasaki, Y., Shikada, K., Yamagishi, M., Hoshino, K., Kaisho, T., Takemoto, K., Suzuki, T., Kuranaga, E., Ohara, O., Miura, M.
  • Journal Title: Cell Reports Volume: 8 Pages: 974-982
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2014.07.012
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] Live-imaging of caspase-1 activation reveals an all-or-none response of inflammasome signaling. (2014)
  • Author(s): Liu, T., Yamaguchi, Y., Shirasaki, T., Shikada, K., Yamagishi, M., Hoshino, K., Kaisho, T., Takemoto, K., Suzuki, T., Kuranaga, E., Ohara, O., and Miura, M.
  • Organizer: The International Symposium on Mechanisms of Innate Immunity, Cell Death and Inflammation
  • Place of Presentation: Ghent, Belgium
  • Year and Date: 2014-09-25 – 2014-09-26
• [Presentation] カスパーゼ１活性の可視化から明らかになったインフラマソーム活性化様式. (2014)
  • Author(s): Liu, T., Yamaguchi, Y., Shirasaki, T., Shikada, K., Yamagishi, M., Hoshino, K., Kaisho, T., Takemoto, K., Suzuki, T., Kuranaga, E., Ohara, O., and Miura, M.
  • Organizer: 第19回 日本病態プロテアーゼ学会学術集会
  • Place of Presentation: 大阪
  • Year and Date: 2014-08-08 – 2014-08-09