オートファジーを支える膜動態の解析に基づく細胞内膜形成機構の解明

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15002012
• Research Institution: Okazaki National Research Institutes
• Principal Investigator: 大隅 良典 岡崎国立共同研究機構, 基礎生物学研究所, 教授 (30114416)
• Keywords: オートファジー / Atg / 酵母 / ユビキチン様タンパク質 / 膜形成 / オートファゴソーム

Research Abstract

本研究課題の第1年次にあたり、得られた主な成果は以下の通りである。主として今後の展開のための準備に多くの労力を割いた。
1.Atg12と、Atg5の結合体はさらにAtg16と大きな複合体を形成して初めて機能を発揮する。データベース上には哺乳類等にはAtg16のホモログが存在しないが、複合体の解析からWD repeatを有する遙かに大きなタンパク質がAtg16と同等の機能をしていることが明らかになりAtg16Lと命名した。恐らく他のAtg因子も高等動植物にも機能的に保存されているものと思われる。
2.精製したAtg8ΔR, Atg7,Atg3とPEを含むリポソームにより、極めて効率よくAtg8-PEを形成する反応系を確立した。この系を用いて基質となるPEの存在状態等に関する新たな知見が得られた。
3.Atg12に種々の変異を導入し、ユビキチンフォールドが機能に必須であること、結合体形成は正常でありながら、オートファジーの活性を失う変異体があることが明らかとなった。
4.オートファジーによって選択的に分解を受けるタンパク質のスクリーンの結果、細胞質アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼが24時間後にはオートファジーによって分解を受けることが明らかとなった。その機構の解明を進めている。
5.オートファゴソーム形成過程を可視化し、Atg因子間の相互作用ネットワークを明らかにする目的で、全Atgタンパク質のGFP融合タンパク質を本来の染色体から全てのatg変異株で発現させ、その局在の網羅的な解析を開始し、今後短期間に完了する目途が立った。
6.PASを構造体として電子顕微鏡で捉えるために全Atgタンパク質のHA-タッギングを開始し、免疫電顕による解析に着手した。さらにAtgタンパクを精製し全Atgタンパク質に対する抗体の作製を進めた。

Research Products

• [Publications] Mizushima, N., Kuma, A., Kobayashi, Y., Yamamoto, A., Takao, T., Natsume, T., Ohsumi, Y., Yoshimori, T.: "Mouse Apg16L, a novel WD repeat protein, targets to the autophagic isolation membrane with the Apg12-Apg5 conjugate"J.Cell Sci.. 116. 1679-1688 (2003)
• [Publications] Hamasaki, M., Noda, T., Ohsumi, Y.: "The early secretory pathway contributes to autophagosome formation."Cell Struc.Func.. 28. 49-54 (2003)
• [Publications] Sugawara, K., Suzuki, N., Fujioka, Y., Mizushima, N., Ohsumi, Y., Inagaki, F.: "Crystalization and preliminary X-ray analyses of LC3-I"Acta Crys.. D59. 1464-1465 (2003)
• [Publications] Mukaiyama, H., Baba, M., Osumi, M., Aoyagi, S., Kato, N., Ohsumi, Y., Sakai, Y.: "Modification of Ubiquitin-like protein Paz2 conducted micropexophagy through formation of a membrane structure"Mol.Biol.Cell.. (in press). (2003)
• [Publications] Qu X, Yu J, Bhagat G, Furuya N, Hibshoosh H, Troxel A, Rosen J, Eskelinen EL, Mizushima N, Ohsumi Y, Cattoretti G, Levine B.: "Promotion of tumorigenesis by heterozygous disruption of the beclin 1 autophagy gene"J.Clin.Invest. 112. 1809-1820 (2003)
• [Publications] Klionsky DJ, Cregg JM, Dunn WA Jr, Emr SD, Sakai Y, Sandoval IV, Sibirny A, Subramani S, Thumm M, Veenhuis M, Ohsumi Y.: "A Unified Nomenclature for Yeast Autophagy-Related Genes"Dev.Cell. 5. 539-545 (2003)
• [Publications] Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y.: "In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker"Mol.Biol.Cell. (in press). (2004)
• [Publications] Ohsumi, Y.: "Cellular recycling system-molecular mechanism of autophagy"In Cell Growth, Cold Spring Harbor Press. (in press). (2003)
• [Publications] Ohsumi, Y., Mizushima, N.: "Two ubiquitin-like conjugation systems essential for autophagy"Sem.Cell.Dev.Biol.. (in press). (2004)