2003 Fiscal Year Annual Research Report
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15029235
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
佐甲 靖志 大阪大学, 生命機能研究科, 助教授 (20215700)
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| Keywords | 神経成長因子 / 1分子計測 / Rho / Rac / PC12 / GFP / 半導体ナノ粒子 |
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| Research Abstract |
神経細胞の軸策伸長部位と伸長方向の決定機構を解明することを目指して、我々の開発した細胞内1分子可視化計測などの手法を使い、細胞膜に存在する2種の神経成長因子(NGF)受容体(p75とtrkA)、Ras,RhoファミリーGTPaseなどの分子の情報伝達反応の細胞内可視化解析法の開発とそれを利用した分子動態計測を行った。
(1)p75受容体の動態計測:p75と緑色蛍光タンパク質(GFP)の融合遺伝子を、神経モデル細胞であるPC12に発現させ、1分子運動解析を行った。NGFの添加によって、不動成分が5%から15%に増加するととともに、可動性分の拡散係数は7x10^<-2>μm^2/sから17x10^<-2>μm^2/sへと約2.4倍増加すること、すなわちNGFによる受容体の運動様式の分化を見いだした。
(2)NGF結合と神経突起伸長の計測:PC12細胞のサブクローンPC12DのNGFによる神経突起様伸長において、突起の形成部位決定と伸長機構を明らかにするために、細胞運動と突起伸長の関係を計測した。NGF添加後細胞全体で伸長・収縮運動がおこり、伸長部位では運動周期の短縮により他の部位よりも速い伸長がおこることが分かつた。NGFの結合と運動周期短縮の分子機構を研究するため、半導体ナノ粒子で標識したNGFを作成し、NGF結合部位、結合時間を1分子レベルで定量的に計測できる方法を開発した。今後NGF入力と伸展収縮運動変化の関係を計測する。
(3)神経成長円錐におけるRhoファミリーGTPaseの1分子可視化:培養系の神経芽細胞NG-108が安定に神経成長円錐を形成する培養法と、細胞内にRho,RacおよびそのエフェクターRhotekin,PAKそれぞれのGFP融合タンパク質を発現させる方法を開発した。
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[Publications] Hibino, K., et al.: "Single- and multiple-molecule dynamics of the signaling from H-Ras to c-Raf1 visualized on the plasma membrane of living cells."Chem.Phys.Chem.. 4. 748-753 (2003)
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[Publications] Sako, Y., Yanagida, T.: "Single-molecule visualization in cell biology."Nature Rev.Mol.Cell Biol.. 4. SS1-SS5 (2003)
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[Publications] Sako, Y., et al.: "Single-molecule visualization of cell signaling processes of epidermal growth factor receptor."J.Pharmacol.Sci.. 93. 253-258 (2003)
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[Publications] Murai, T., et al.: "Engagement of CD44 promotes Rac activation and CD44 cleavage during tumor cell migration."J.Biol.Chem.. 279. 4541-4550 (2004)
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[Publications] 佐甲靖志: "細胞内情報処理過程の1分子観察"生理学会誌. 65. 277-282 (2003)
